专利名称：一种融合基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种融合基因，尤其涉及一种含有信号肽的融合基因及其应用。
背景技术：
1.核酸疫苗核酸疫苗或DNA疫苗，是指将编码外源性抗原的基因插入到真核表达载体上，然后直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，该抗原蛋白可直接诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统产生应答反应，从而达到预防疾病的目的。DNA疫苗可分别活化机体免疫系统，产生特异性的抗体和细胞免疫应答。与传统疫苗相比，DNA疫苗具有如下优点:1、质粒DNA非常稳定，易于贮存和运输，使用方便。而且制备简单，容易大量生产，成本低。2、质粒DNA在宿主体内可较长时间存在，抗原基因在体内持续表达产生抗原蛋白，不断刺激机体免疫系统产生长程免疫，免疫效果可靠。3、基因疫苗不仅可以产生体液免疫应答，而且可以导致细胞毒素T淋巴细胞激活而诱导细胞免疫，而传统的疫苗只有活苗可诱导细胞免疫，但存在活疫苗的毒力回升的危险。4、用核心蛋白保守DNA序列制备的基因疫苗对病原体(细菌或病毒)的各变异亚型都可产生免疫应答，从而避免因病原体变异而造成的免疫逃避问题。5、一个质粒载体可克隆多个抗原基因组成多价苗，从而一种基因疫苗可预防多种疾病。6、质粒DNA无免疫原性，不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应。尽管有上述优点，但整体而言，DNA疫苗免疫原性较常规疫苗制品(如蛋白疫苗、灭活疫苗)弱，需要新型载体或佐剂辅助，以提高免疫应答。2.信号肽 另外，某些病原体抗原(比如肠道病毒71型VPl)不具有信号肽，不能分泌性表达，因而直接表达此类抗原基因的核酸疫苗限于细胞内表达，未能充分与MHC II类分子结合，影响Th2型特异性细胞免疫，从而影响了针对此类抗原的抗体应答。因此，开发能高效分泌性表达的信号肽有助于提高活化抗体应答。另一方面，基因治疗有时也会涉及分泌型表达，某些细胞因子自身携带的信号肽序列可能基于天然的原因，并非能高效分泌表达产物，但涉及该细胞因子的基因治疗却需要高效分泌形式的表达，因而，将该细胞因子信号肽序列替换为高效分泌的信号肽序列，也有助于提闻基因治疗的效果。关于信号肽基因用于核酸疫苗的研究也广泛记载于已有文献中。早在核酸免疫研究开始时，就有研究人员探讨了信号肽融合抗原的核酸免疫效果。Wagener等将异源信号肽基因与猴免疫缺陷病毒(SIV)抗原融合，并活化产生了针对SIV抗原的抗体应答(J.Biotechnol.44，59-65.1996)。Letvin 等将纤溶酶原激活物(tissue plasminogenactivator, tPA)信号肽与人免疫缺陷病毒(HIV)包膜糖蛋白gpl20和gpl60分别融合，形成嵌合基因疫苗载体，该疫苗载体能活化产生较好的细胞免疫应答和体液免疫应答(PNAS.94，9378-9383.1997)。但是tPa信号肽融合对抗体应答的效果是不稳定的，有时tPA无法达到提高抗体应答的效果。Li等研究tPA信号肽对结核抗原免疫原性的影响，发现对tPA信号肽对部分抗原有效果，能显著提高体液免疫应答(INFECTION AND IMMUNITY.67，4780-4786.1999)。Haddad等对比了 tPA信号肽融合与否对抗体应答的效果，然而其结果表明，tPA信号肽与目的抗原融合并未增强抗体的应答水平(FEMS Immunology and MedicalMicrobiology.18，193-202.1997)。同时，信号肽对核酸疫苗免疫原的影响多数集中在tPA的研究上，其他的信号肽应用较少，目前还很少有高效的其他信号肽用于核酸疫苗的研究。方艳辉等(中华微生物学和免疫学杂志，第3期，2004)记载了人IL-2信号肽基因增强了柯萨奇病毒B3型VPlDNA疫苗诱导的中和抗体应答。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种含有信号肽的融合基因、其表达载体、以及所述融合基因及表达载体的应用。本发明的融合基因能在细胞或生物体内能分泌性表达目的基因，从而较为稳定地提高抗体应答水平，因而可用于旨在提高抗体保护效果的预防性或治疗性疫苗产品，比如DNA疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗。此外，本领域普通技术人员可以根据本发明，将含所述信号肽的融合基因及其表达载体通过基因治疗的方式导入生物体内，以产生分泌性表达的目的基因，从而具有某种治疗效果，比如高效分泌性表达细胞因子，以用于治疗癌症等疾病。除非另外地指出，本申请说明书中的“融合基因”指信号肽编码序列与除天然相连的自身编码序列外的目标基因融合得到的基因。比如融合基因可以是纤连蛋白信号肽编码序列与除纤连蛋白外的目标基因融合得到的基因，也可以是层粘连蛋白信号肽编码序列与除层粘连蛋白外的目标基因融合得到的基因，还可以是胶原蛋白信号肽编码序列与除胶原蛋白外的目标基因融合得到的基因。本发明总地来说涉及一种包含信号肽编码序列和目标基因序列的融合基因，包含其的表达载体，上述融合基因和表达载体表达产生的融合蛋白，包含上述融合基因和表达载体的宿主有机体，和包含上述融合基因和表达载体的用于引起免疫反应或基因治疗的产品(如DNA疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗)，上述的融合基因、表达载体、融合蛋白、产品在制备用于引发免疫反应或用于基因治疗的药物中的用途。所述表达载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、逆转录病毒载体和细菌载体。所述宿主细胞包括但不限于真核生物细胞，优选哺乳动物细胞，更优选的是源于人的细胞。具体地，本发明提供了以下的技术方案:在本发明的一个方面，提供了一种融合基因，该融合基因包含信号肽编码序列和目标基因序列，并且所述的 信号肽编码序列编码的信号肽与人纤连蛋白信号肽、人层粘连蛋白信号肽或人胶原蛋白信号肽具有至少90%的同源性；优选地，所述的人纤连蛋白信号肽的序列是SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，人层粘连蛋白信号肽的序列是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，并且人胶原蛋白信号肽的序列是SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列；优选地，所述的信号肽编码序列编码的信号肽选自人纤连蛋白信号肽、人层粘连蛋白信号肽和人胶原蛋白信号肽；进一步优选地，所述的信号肽编码序列为:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核酸序列，或者SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核酸序列经简并密码子替换的核酸序列。在本发明一个优选的方面，所述的目标基因是肠道病毒71型VPl ;优选地，所述的融合基因选自:融合基因FNs-VPl (其序列为SEQ ID NO:7所示的核酸序列)、融合基因LNs-VPl (其序列为SEQ ID NO:8所示的核酸序列)和融合基因CNs-VPl (其序列为SEQ IDN0:9所示的核酸序列)。在本发明的另一个方面，提供了一种表达载体，其包含前文所述的融合基因；优选地，所述的表达载体是由PVAXl制成的。在本发明一个优选的方面，所述的表达载体的核酸序列选自SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示的核酸序列；进一步优选地，所述的表达载体选自质粒载体、病毒载体、逆转录病毒载体和细菌载体。在本发明的另一个方面，提供了一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是由前文所述的融合基因或表达载体表达得到的；优选地，所述的融合蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14 和 SEQ IDN0:15 所示的氨基酸序列。在本发明的还一个方面，提供了一种用于引起免疫反应或基因治疗的产品，所述产品包括前文所述的表达载体；优选地，所述产品为药物、试剂或试剂盒；再优选地，所述产品是DNA疫苗。在本发明的又一个方面，提供了一种制备所述产品的方法，该方法包括将前述的融合基因插入到已知的载体中的步骤；优选地，所述的载体选自真核表达质粒载体和病毒载体，所述真核表达质粒载体优选选自pVAXl、pcDNA和pVAXl，所述病毒载体优选选自腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘苗病毒和流感病毒载体；进一步优选地，所述的载体是PVAXI ο在本发明的另一个方面，提供了一种宿主有机体，其特征在于含有前文所述的融合基因或前文所述的表达载体；优选地，所述宿主有机体包括但不限于真核生物细胞；再所述宿主有机体是哺乳动物 细胞，例如是源于人的细胞；再更优选地，所述的宿主有机体为Hela细胞。在本发明的另一个方面，提供了前文所述的融合基因、前文所述的表达载体、前文所述的融合蛋白或前文所述的产品在制备用于引发免疫反应的药物中的用途。在本发明的另一个方面，提供了前文所述的融合基因、前文所述的表达载体、前文所述的融合蛋白或前文所述的产品在制备基因治疗的药物中的用途。本发明还提供了如下的技术方案:本发明提供了一种新的融合基因，其特征在于包含:(I)选自由以下信号肽编码序列组成的组:纤连蛋白(fibronectin, FN)信号肽、层粘连蛋白(laminin, LN)信号肽、胶原蛋白(collagen, CN)信号肽；(2)目的基因编码序列，优选不含信号肽编码序列的目的基因。本发明还提供了包含上述融合基因的载体，其特征在于通过分子克隆方法将上述融合基因插入载体相应区域。本发明还提供了用于引起免疫反应或基因治疗的产品，其特征在于包含上述融合基因。本发明还提供了本发明融合基因或融合基因表达载体在引起免疫反应或基因治疗上的应用。因而，本发明提供了上述3种信号肽与目的抗原的融合基因，并利用融合基因构建了相应的DNA疫苗，并描述了实施融合基因DNA疫苗的有益效果。总之，本发明的信号肽融合基因在保持活化产生同等的T细胞免疫应答的同时，能活化产生较高水平的抗体应答，从而提高基因治疗或疫苗的效果，从而在蛋白制备以及引发更高水平的免疫反应方面具有广泛的用途。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:图1显示了所述载体在真核细胞系中的表达VPl蛋白的免疫杂交印迹图；图2 显示了注射了 pVAXl-VPl，pVAXl-FNs-VPl 和 pVAXl-LNs-VPl 载体的小鼠的活化T细胞免疫应答结果；图3 显示了注射了 pVAXl-VPl，pVAXl-FNs-VPl，pVAXl-LNs-VPl 载体的小鼠的血清中活化产生的抗体滴度结果。
具体实施例方式实施例1:VP1表汰载体构律人密码子优化的肠道病毒71型(EV71)的VPl基因片段由上海捷瑞全基因合成，序列为SEQ ID NO: 16所示的核酸序列。将该基因片段通过分子生物学方法插入pVAXl疫苗载体(货号V260-20，invitrogen)中，构建成pVAXl-VPl载体(其序列为SEQ ID N0:25所示的核酸序列)，切位点为KpnI (Takara, 50U/ μ L)和EcoR I (Takara, 15U/ μ L),具体方法与步骤可参考《分子克隆(第三版)》(〔美〕J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)，并为本领域普通技术人员熟知。将鉴定正确的克隆送英骏生物技术有限公司测序，序列正确。用Endo-free质粒大量抽提试剂盒(购自QIAGEN，GE)按照试剂盒生产商的说明书所述的方法批量制备pVAXl-VPl供后续试验。实施例2 =FNs-YPl融合基因及其表达载体构建根据人纤连蛋白信号肽氨基酸序列MLRGPGPGLLLLAVQCLGTAVP(SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列)进行真核密码子优化，设计引物。该信号肽的编码核酸的真核密码子优化序列为SEQ ID NO:1所示的核酸序列。使用的引物包括了 pVAXIFNs-Fl (其序列为SEQ ID NO: 18所示的核酸序列)、pVAXlFNs-F2 (其序列为SEQ ID NO: 19所示的核酸序列)和pVAXIPrimer R (其序列为SEQID NO:20所示的核酸序列)，引物由英骏生物技术有限公司合成。总共进行两轮PCR，体系分别如下。表1:FNs-VP I融合基因及其表达载体构建第一轮PCR体系
权利要求
1.一种融合基因，其包含信号肽编码序列和目标基因序列，并且所述的信号肽编码序列编码的信号肽与人纤连蛋白信号肽、人层粘连蛋白信号肽或人胶原蛋白信号肽具有至少90%的同源性； 优选地，所述的人纤连蛋白信号肽的序列是SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，人层粘连蛋白信号肽的序列是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，并且人胶原蛋白信号肽的序列是SEQID NO:6所示的氨基酸序列； 再优选地，所述的信号肽编码序列编码的信号肽选自人纤连蛋白信号肽、人层粘连蛋白信号肽和人胶原蛋白信号肽。
2.权利要求1所述的融合基因，其中: 所述的信号肽编码序列为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核酸序列，或者SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核酸序列经简并密码子替换的核酸序列。
3.权利要求1或2所述的融合基因，其中所述目标基因是肠道病毒71型VPl; 优选地，所述的融合基因的核酸序列选自:SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的核酸序列。
4.一种表达载体,其包含权利要求1-3中任一项所述的融合基因； 优选地，所述的表达载体是由PVAXl制成的； 再优选地，所述的表达载体的核酸序列选自SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ IDNO: 12所示的核酸序列； 进一步优选地，所述的表达载体选自质粒载体、病毒载体、逆转录病毒载体和细菌载体。
5.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是由权利要求1-3中任一项所述的融合基因或权利要求4所述的表达载体表达得到的； 优选地，所述的融合蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 13, SEQ IDN0:14和SEQ IDNO: 15所示的氨基酸序列。
6.一种用于引起免疫反应或基因治疗的产品，所述产品包括权利要求4所述的表达载体，优选地，所述产品为药物、试剂或试剂盒；再优选地，所述的产品是DNA疫苗。
7.一种制备权利要求6所述的产品的方法,该方法包括将权利要求1-3中任一项所述的融合基因插入到已知的载体中的步骤；优选地，所述的载体选自真核表达质粒载体和病毒载体，所述真核表达质粒载体优选选自PVAX1、pcDNA和pVAXl，所述病毒载体优选选自腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、痘苗病毒和流感病毒载体；进一步优选地，所述的载体是PVAXI ο
8.—种宿主有机体，其特征在于，该宿主有机体含有权利要求1-3中任一项所述的融合基因或权利要求4所述的表达载体； 优选地，所述宿主有机体包括真核生物细胞； 进一步优选地，所述宿主有机体是哺乳动物细胞，例如是源于人的细胞； 再进一步优选地，所述的宿主有机体为Hela细胞。
9.权利要求1-3中任一项所述的融合基因、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的融合蛋白或权利要求6所述的产品在制备用于引发免疫反应的药物中的用途。
10.权利要求1-3中任一项所述的融合基因、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的融合蛋白或权利要求6 所述的产品在制备基因治疗的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种融合基因及其应用，具体为包含信号肽编码序列和目标基因序列的融合基因，包含其的表达载体，该融合基因或其表达载体表达得到的融合蛋白，用于引起免疫反应或基因治疗的产品，包含该融合基因的细菌，以及上述的融合基因、表达载体、融合蛋白和产品在制备用于引发免疫反应或用于基因治疗的药物中的用途。同时本发明还提供了制备上述产品的方法。本发明的信号肽融合基因在保持活化产生同等的T细胞免疫应答的同时，能活化产生较高水平的抗体应答，从而提高基因治疗或疫苗的效果，从而在蛋白制备以及引发更高水平的免疫反应方面具有广泛的用途。
文档编号A61K48/00GK103160530SQ20131008836
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者徐建青, 黄杨 申请人:苏州工业园区唯可达生物科技有限公司