专利名称：一种caspase-ERLBD融合基因的制作方法
一种caspase-ERLBD |虫合基因技术领域
本发明属于细胞凋亡调控技术领域，涉及一种caspase-ERLBD融合基因。
技术背景
1、Caspase与细胞凋亡信号传递
细胞凋亡作为一种自发的程序化的死亡过程，在多细胞生物的组织分化、器官发 育、机体稳态的维持中有着重要意义，并参与多种疾病的病理过程。半胱天冬酶(caspase) 是不同凋亡途径中共同的末端蛋白酶，目前该家族已发现了 14个成员，它们都具有相似的 结构和功能，如活性位点含有半胱氨酸，识别蛋白质中特定的四肽序列，并在天冬氨酸羧基 侧切割底物等。caspase在细胞中以酶原形式存在，包含1个N端原结构域(prodomain)、 大亚基和小亚基。在上游凋亡信号作用下，caspases被切割活化，游离的大、小亚基结合成 活性caspase分子，引发细胞凋亡。
根据caspases的结构及作用底物不同，分为两类①起始caspase (上游 caspase)，如caspase-2，_8，_10等，具有长的原结构域，在上游信号的作用下，分子间 借助该结构域发生同源聚集并活化，活化后作用于下游caspase ；②效应caspase (下游 caspase)，如caspase-3，_6，_7等，原结构域较短，可被上游caspases活化，在稳定聚集时 也可相互切割活化，活化后广泛作用于细胞结构和功能蛋白，诱发细胞凋亡。
细胞发生凋亡时，caspase可以通过多种信号途径被激活。细胞表面存在着 一类以Fas为代表的“死亡受体”，属表皮生长因子受体超家族。细胞外的凋亡信号，如 细胞毒性淋巴细胞(CTL)等分泌的Fas配体(FasL)与Fas结合，引起Fas分子三价聚 集，Fas通过接头分子FADDO^as-associated deathdomain)募集具有较长原结构域的 caspaseS，使后者也发生同源聚集，并通过分子间的相互切割而活化，进一步激活下游效应 caspase (caspase-3, -6，_7等)，形成一种级联反应，将凋亡的信号扩大。
近年来的研究表明，在上游信号的诱导下，起始caspase分子相互接近，并形成同 源二聚体是caspase活化的关键步骤，同时在适当条件下，同源聚集的效应caspase (如 caspase-3)也可以发生活化。活化的效应caspase作用于细胞内多种底物蛋白，导致细胞 骨架和核纤层解体，中断DNA复制和修复并降解染色体DNA，阻止mRNA拼接，促进凋亡小体 的形成。另外，射线照射和细胞毒物质等也可以诱发细胞凋亡，这类凋亡信号途径通常需要 线粒体参与。线粒体释放的细胞色素C与接头分子Apaf-I —起激活caspase-9，进而活化 效应caspase，引起细胞凋亡。
2、Caspase聚集活化的诱导模型
随着细胞中caspase分子活化的内在机制的阐明，人们试图通过人为的诱导 caspase分子之间的聚集而活化这些分子，诱导细胞凋亡，从而有效地杀伤肿瘤细胞。有 研究者将大环内脂类药物Π(506的结合结构域与caspase融合，然后应用Π(506的二聚 体FK1012，可以有效地促进caspase的二聚化和切割活化(Yang X，Chang HY, Baltimore D. Autoproteolytic activation ofpro-caspases by oligomerization, Mol Cell 1998 ；1 =319-325)，而利用抗体的Fc片段和caspase融合诱导后者聚集的研究也有报道(Shi Y.Caspase activation :revisiting the induced proximity model. Cell，2004 ；117 855-858)。但上述这些方法或者需要依赖外源药物诱导，从而增加了药物潜在的毒副作用， 或者caspase的聚集活化不受调控，因此限制了它们在肿瘤治疗中的成功应用。
3、雌激素-雌激素受体信号途径与肿瘤的发生
雌激素是由卵巢等组织分泌的类固醇激素，它通过与机体多种靶组织细胞中的受 体结合，对生殖系统、乳腺、骨骼、神经及心血管系统的发育和功能发挥调节作用。雌激素在 临床上被用于预防和治疗更年期综合症、骨质疏松、心血管疾病等，但体内长期高水平雌激 素的刺激可导致许多组织的癌变。
研究表明，雌二醇(estradiol，E2)及其几种代谢产物是诱发乳腺癌、子宫内膜癌 的重要因素。另外，人们很早就发现，雌激素受体(ER)的过表达与乳腺癌和一些妇科肿瘤 的发生相关，雌激素与其受体结合成为具有活性的转录因子，启动多种基因的转录，促进细 胞增殖并抑制细胞凋亡信号通路。同时，它也是化疗时肿瘤产生耐药性的重要原因(Hall JM, Couse JF, KorachKS.The multifaceted mechanisms of estradiol and estrogen receptor signaling. J Biol Chem，2001 ;276 :36869-36872)。近年来出现了一类选择性 激素调节剂(SERMs)，如三苯氧胺(tamoxifen)、TAT-59等，它们多通过与雌激素竞争结合 受体而消除雌激素的致癌效应，但有实验表明，三苯氧胺长期应用也有类似雌激素的副作 用(Norris JD, Paige LA, Christensen DJ, et al. Peptideantagonists of the human estrogen receptor. Science，1999 ；285 :744-6)。
ER是甾醇类激素受体的一种，定位于细胞核以及细胞质中，现已发现了 ER-α、 ER-β两种结构类型。ER两种亚型表达的组织特异性，以及不同细胞表达的辅激活因子的 差异，是雌激素-雌激素受体信号途径具有多种生物学效应的重要原因。
成熟ER-α蛋白包含4个功能结构域N端的主要转录功能区；DNA结合区，并与蛋 白质的细胞核定位有关；激素结合区；C端的激素依赖性二聚化及转录功能区。另外，肿瘤 和正常人体细胞中均有ER的变异体存在。ER在细胞中通常与热休克蛋白HSP90结合而不 具有转录激活活性，当与激素等配体结合后，构象发生变化，与HSP90解离，形成稳定的二 聚体，并与DNA中具有回文结构的特定元件(ERE)结合，随后ER可以通过不同的辅激活因 子与靶基因的转录元件相互作用，启动基因转录。
除了依赖配体的经典途径外，一些多肽类激素经过细胞内信号传递，也可以通过 磷酸化而激活ER，促进下游靶基因的表达。另外，ER还可以与R)s、Jim等蛋白作用，并与 DNA上的AP-I位点结合影响转录，在这方面，ER-α和ER-β的作用相反，前者启动转录，后 者则抑制转录。雌激素-雌激素受体复合物还通过与MAPK和磷脂酰肌醇3-激酶/Akt途 径相互作用，以一种非转录依赖的方式调节骨骼、心血管系统的发育和功能。发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种caspase-ERLBD融合基因，该融合基因作为 一种自杀性基因，所表达的蛋白能够识别雌激素并特异性的与其结合，在雌激素的诱导下 能够发生聚集活化。
本发明是通过以下技术方案来实现
一种caspase-ERLBD融合基因，由caspase8基因与ERa的配体结合区基因连接 而成，caspase-ERLBD融合基因表达的融合蛋白caspase-ERLBD能够识别雌激素并特异性 的与其结合。
所述的融合蛋白caspase-ERLBD与雌激素结合后，触发融合蛋白caspase-ERLBD 的二聚化，使融合蛋白中的caspase通过分子间交互切割而活化。
所述的caspase-ERLBD融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
所述的雌激素能够特异性的结合于转染caspase-ERLBD融合基因并表达 caspase-ERLBD融合蛋白的细胞。
所述的雌激素与表达caspase-ERLBD融合蛋白的细胞结合后，触发融合蛋白 caspase-ERLBD的二聚化，使融合蛋白中的caspase通过分子间交互切割而活化，诱导细胞凋亡。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果
1、本发明所构建的caspase8_ERLBD融合基因，通过将caspase8基因与ERa的 配体结合区基因连接，caspase-ERLBD融合基因表达的融合蛋白caspase-ERLBD能够识 别雌激素并特异性的与其结合，触发融合蛋白caspase-ERLBD的二聚化，使融合蛋白中的 caspase通过分子间交互切割而活化，使其中的caspase发生分子间切割而活化，促进细胞凋亡。
Western blot检测道路了融合基因表达后的融合蛋白在收到E2诱导之后 的二聚化，并且非变性蛋白质凝胶电泳实验检测到二聚化后的融合蛋白发生了切割 活化，caspaseS被切割成大亚基和小亚基两部分。进一步，证实了在E2诱导下，转 染了 caspase-ERLBD融合基因的肿瘤细胞的增殖在体内、体外受到了明显的抑制， caspase-ERLBD融合基因能够促进细胞凋亡。
2、与现有的肿瘤细胞“自杀基因”相比，本发明利用细胞内的天然小分子物质雌激 素诱导死亡分子caspase的活化和细胞死亡，因此无需再像其他“自杀基因”系统一样，在 导入并表达“自杀基因”的同时，还要其他的外源药物诱导。从而避免了药物潜在的毒副作 用，或者caspase的聚集活化不受调控的缺陷。
3、与现有的诱导caspase活化的模型相比，本发明利用雌激素诱导caspase的聚 集、切割和活化，由于雌激素已经被证实与乳腺癌等多种肿瘤的发生呈现正相关，因此本发 明构建的融合基因在转入细胞后可望逆转雌激素促进细胞增殖和癌变的效应。
4、与现有的雌激素受体靶向的肿瘤治疗药物(如tamoxifen)相比，本发明构建的 caspase-ERLBD融合蛋白，不仅仅是简单地封闭雌激素受体的功能和雌激素信号途径，而是 利用雌激素诱导表达融合蛋白的肿瘤细胞发生凋亡，因而能够有效地杀伤肿瘤细胞。
图1为caspase-ERLBD融合基因构成示意图。
图2 S^festern blot (caspaseS抗体)检测融合基因转染的细胞中融合蛋白的表 达。
图3为非变性聚丙烯酰胺电泳证实融合蛋白二聚体的形成。
图4为免疫共沉淀证实lOOnmol/L E2诱导下融合蛋白的聚集，其中融合蛋白分别带有Flag和His标签。
图5为Western blot检测100nmol/L雌二醇(E2)诱导前后转染细胞中caspase8 的加工剪切。
图6为MTT法检测lOOnmol/L E2诱导前后转染细胞的增殖。
图7为Annexin V和PI染色后流式细胞术检测细胞凋亡(Annexin V+和PI-细 胞为早期凋亡细胞)。
图8为caspaseS-ERLBD融合基因转染细胞和未经转染细胞皮下接种裸鼠形成的 肿瘤。
图9为两周一次lOOnmol/L雌二醇(E2)或生理盐水(ctrl)瘤内注射对肿瘤生长 的影响。
图10为肿瘤组织HE、免疫荧光和TUNEL染色结果图。
具体实施方式
下面结合融合基因及其表达载体的构建、融合基因表达后的融合蛋白及其收到诱 导后的二聚化、分子间切割活化的检测、转染了 caspase-ERLBD融合基因的肿瘤细胞的促 细胞凋亡的检测和验证，对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、Caspase8-ERLBD融合基因的制备和表达载体的构建
1. lCaspase8_ERLBD 融合基因的制备
通过KpnIAhoI酶切位点将人工克隆的人ERa基因亚克隆入pcDNA3表达载体， 获得pcDNA3_ERa表达载体。
人caspase8基因(GenBank登录号匪_033；356)分为C8-1和C8-2两个片段分别 从人淋巴瘤Jurkat细胞中克隆在提取Jurkat细胞的总RNA之后，反转录成cDNA ；以cDNA 为模板，分别用C8-1F、C8-1R作为引物对以及C8-2F、C8-2R作为引物对(引物序列如表1 所示)，PCR扩增C8-1和C8-2片段。
将扩增的C8-1和C8-2片段分别用HindIII/Ncol和Ncol/Kpnl进行双酶切，酶切 之后连接得到带黏性末端的CS(CaspaseS)基因片段，并将其通过Hindlll/Kpnl酶切位点 克隆入pcDNA3-ER α表达载体，得到pcDNA3_C8/ER表达载体，并测序证实其序列插入正确。
为了获得caspase8和ERaLBD融合基因，首先用CE-IF和CER作为引物对(引物 序列如表1所示)，以pcDNA3-C8/ER载体为模板，PCR扩增获得长度为417bp的第一片段； 其次，以所获的第一片段为模板，用CE-2F和CER作为引物对，PCR扩增获得长度为443bp的 第二片段；然后将被Ncol/Kpnl酶切后的第二片段，与pcDNA3-C8/ER载体用NcolAbaI酶 切后获得的长度为610bp的第三片段连接，获得带KpnIAbaI黏性末端的第四片段；再将第 四片段通过KpnIAbaI酶切位点克隆入pcDNA3_C8/ER载体，获得pcDNA3_C8/ERL载体，并 测序证实插入序列正确；与PCDNA3序列比对，获得CaSpaSe8基因与ER α的配体结合区基 因连接而成的caspaseS-ERLBD融合基因(C8/ERL)，融合基因的结构示意图如图1所示，其 具体的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
1. 2含有标签的融合基因表达载体的构建
为了构建含有标签的融合蛋白表达载体，以pcDNA3-C8/ERL载体为模板，以用 C8-3F和ERR为引物对进行PCR扩增，获得融合基因C8/ERL片段，并通过BamHI/MlI酶切位点将扩增的C8/ERL片段连接入pBabe-puro载体，获得含有Flag标签的pBP_Flag-C8/ ERL载体；
以pcDNA3-C8/ERL载体为模板，分别用MCE-IF和MCE-IR作为引物对、MCE-2F和 FCER作为引物对进行PCR扩增，所获得的长度为680bp的第五片段和长度为600bp的第六 片段；用EcoRI/Apal酶切pcDNA3_C8/ERL载体，并将所获的1. 8kb片段通过EcoRI/Apal位 点克隆入pcDNA3/Myc-His A载体，然后再通过Xbal/Apal位点和BamHI/EcoRI位点，分别 将酶切后的第五片段和第六片段克隆入载体，终获得含Myc、His标签的pHis-C8/ERL载体。
上述1. 1和1. 2在融合基因和其表达载体过程所用引物序列如表1所示
表1引物序列表
权利要求
1.一种caspase-ERLBD融合基因，其特征在于，由caspase8基因与ERα的配体结合区 基因连接而成，caspase-ERLBD融合基因表达的融合蛋白caspase-ERLBD能够识别雌激素 并特异性的与其结合。
2.如权利要求1所述的caspase-ERLBD融合基因，其特征在于，所述的融合蛋白 caspase-ERLBD与雌激素结合后，触发融合蛋白caspase-ERLBD的二聚化，使融合蛋白中的 caspase通过分子间交互切割而活化。
3.如权利要求1所述的caspase-ERLBD融合基因，其特征在于，caspase-ERLBD融合基 因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
4.如权利要求1所述的caspase-ERLBD融合基因，其特征在于，雌激素能够特异性的结 合于转染caspase-ERLBD融合基因并表达caspase-ERLBD融合蛋白的细胞。
5.如权利要求4所述的caspase-ERLBD融合基因，其特征在于，雌激素与表达 caspase-ERLBD融合蛋白的细胞结合后，触发融合蛋白caspase-ERLBD的二聚化，使融合蛋 白中的caspase通过分子间交互切割而活化，诱导细胞凋亡。
全文摘要
本发明公开了一种caspase-ERLBD融合基因，由caspase8基因与ERα的配体结合区基因连接而成，caspase-ERLBD融合基因表达的融合蛋白caspase-ERLBD能够识别雌激素并特异性的与其结合。触发融合蛋白caspase-ERLBD的二聚化，使融合蛋白中的caspase通过分子间交互切割而活化，使其中的caspase发生分子间切割而活化，促进细胞凋亡。与现有的肿瘤细胞“自杀基因”相比，本发明利用细胞内的天然小分子物质雌激素诱导死亡分子caspase的活化和细胞死亡，因此无需再像其他“自杀基因”系统一样，在导入并表达“自杀基因”的同时，还要其他的外源药物诱导，从而避免了药物潜在的毒副作用，或者caspase的聚集活化不受调控的缺陷。
文档编号C12N15/62GK102031267SQ20101054781
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月17日 优先权日2010年11月17日
发明者杨安钢, 白久旭, 贾林涛, 赵智凝 申请人:中国人民解放军第四军医大学