专利名称：用于检测白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相对表达量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类慢性粒细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)以及少数的急性粒细胞白血病(AML)患者体内BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提闻检测精度。
背景技术：
白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制，临床表现为贫血、出血、感·染及各器官浸润症状。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类。急性白血病病情进展迅速，自然病程仅有数周至数月。一般可根据白血病细胞系列归属分为急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)两大类。而慢性白血病的发生是由于有功能的已分化成熟细胞过度增生，因此慢性白血病是一种由于信号传导不良或细胞增殖失控所至的疾患，而非成熟障碍所至。慢性白血病常见有慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。由于白血病类型不同，治疗方案及预后亦不尽相同，因此诊断成立后，应进一步分型。关于人类白血病的病因与发病机理，至今仍未完全明了。已知病因有感染因素、电离辐射、化学物质，遗传因素及免疫功能异常等。目前认为白血病病因是以上各种因素相互作用的结果。人类abl基因位于9号染色体长臂，有lb、Ia和2 11共12个外显子。转录始自Ib或Ia,形成的两种mRNA长度分别为7kb和6kb,合成的两种蛋白质分子量均约为145,前者定位于细胞膜，而后者主要在细胞核内。bcr基因位于22号染色体长臂，有23个外显子。蛋白产物分子量均为160。bcr蛋白第I 63个氨基酸是二聚体化结构，参与bcr蛋白多聚体的形成。bcr蛋白参与细胞周期调节，但详细过程还不十分明确。bcr基因断裂点集中在三个区域主要(major bcr,M_bcr)、次要(minor bcr,m_bcr)和 u ( u -bcr)区域。abl基因断裂位于第I或第2内含子。因断裂点不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。慢性粒细胞白血病的bcr基因断裂点常位于M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量为210kb。在实际应用中，用于检测BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因表达水平的方法主要为荧光原位杂交，尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，结果判读存在较大的主观性，因而一定程度上限制了该法的应用。实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对PCR进行实时检测，可准确反映患者体内BCR/ABL(b3a2，b2a2)的表达情况，节约了大量的检测时间，还避免了残留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料,特异性不如双探针杂交法以及Taqman法,必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于BCR/ABL(b3a2，b2a2)的基因检测。
发明内容
鉴于现有技术中检测BCR/ABL(b3a2，b2a2)的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测白血病BCR/ABL融合基因相对表达量的试剂盒。用于检测白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIZoI、氯仿、无水乙醇、ReverTraAce qPCRRT Kit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、检测目的基因用上下游引物 b3a2-F, b2a2-F, b3a2/b2a2_R，探针 b3a2/b2a2_Probe，检测内参基因 Abl 用引物 abl_F，abl-R,探针 abl-Probe ;其中，b3a2-F GATTTAAGCAGAGTTCAb2a2-F TGTGTGAAACTCCAGACTGT
b3a2/b2a2-R TCCTTGGAGTTCCAACGAb3a2/b2a2-Probe FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRAabl-F GCCGTGAAGACCTTGAAGGAGabl-R ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe :FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG_TAMRA。所述阳性对照品分别为含有b3a2、b2a2基因的溶液；所述阴性对照品为无b3a2和b2a2基因的溶液。其中的ReverTraAce qPCRRT Kit为T0Y0B0公司生产的qPCR用cDNA试剂盒产品。THUNDERBIRD qPCR MIX为T0Y0B0公司生产的定量PCR试剂，产品规格为QPS-101。使用本发明的试剂盒，将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，可以对BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因的表达水平进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。采用双标准曲线法，通过构建BCR/ABL(b3a2，b2a2)和内参基因abl的标准定量曲线，精确定量样本的内参基因拷贝数和BCR/ABL(b3a2，b2a2)拷贝数，相比于以往的免疫组化方法和现今的ACT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。可用于辅助临床上慢性粒细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)以及少数的急性粒细胞白血病(AML)的早期诊断、早期预防及高危人群的筛选。
图I :b2a2阳性结果示意图。图2 :b2a2阴性结果示意图。
图3 :b3a2阳性结果示意图。图4 :b3a2阴性结果示意图。
具体实施例方式实施例I本发明的用于检测白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液；TRIzol ；氯仿；无水乙醇；ReverTra Ace qPCR RT Kit(T0Y0B0 公司);检测体系PCR 反应液THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2X)、b3a2/b2a2 上、下游引物各 0. 8uM、b3a2/b2a2-probe (探针)0. 4uM ；abl 上、下游引物各 0. 8uM、abl-probe (探针)0. 4uM;其中b3a2-F GATTTAAGCAGAGTTCA ；b2a2-F TGTGTGAAACTCCAGACTGT ；b3a2/b2a2-R TCCTTGGAGTTCCAACGA ；b3a2/b2a2-Probe FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRA ；abl-F GCCG TGAAGACC TTGAAGGAG ；abl-R ATGATATAGAACGGGGGCTC ；abl-Probe FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA阳性对照品分别含BCR/ABL (b3a2，b2a2)基因组溶液；阴性对照品不含BCR/ABL(b3a2，b2a2)基因组溶液。实施例2本发明试剂盒的使用方法(I)抽提血液中的组织RNA :在洁净的I. 5ml的离心管中加入Iml红细胞裂解液，取抗凝血0. 5ml混勻。室温静置IOmin ；5000rpm离心5min,弃上清,收集底部的细胞；再次加入0. 5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入ImlTRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min ;加入0. 2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm4°C离心lOmin，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置IOmin ；14000rpm 4°C离心IOmin,弃上清,加入75%乙醇Iml,轻轻上下颠倒洗漆管壁；14000rpm 4°C离心5min,弃乙醇；室温干燥10_15min,加入20ulRNase-free水溶解沉淀。(2)参考T0Y0B0公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为 cDNA。(3)试剂配置按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装X = 23ul反应液X (8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；(4)加样加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA ；阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。(5)检测检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems 公司)等。反应条件95°C预变性 Imin ；95°C 15s, 58°C 35sec 40 个循环，突光信号于58°C 35sec时米集。(6)结果判断将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。I)内参阳性时，检测结果才认为有效；2)阳性判断标准，Ct < 36，为阳性；35 ^ Ct ^ 38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct > 38，为阴性。实施例3采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本取送检的慢性粒细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)以及少数的急性粒细胞白血病(AML)患者抗凝血标本20例,按实施例2所述方法提取基因组RNA、配制试剂并检测。每份标本加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测38份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。实验结果与特检实验室的报告结果相比较，确定样品检测的准确率。部分阳性结果如下表权利要求
1.用于检测白血病BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于 检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、检测目的基因用上下游引物b3a2-F, b2a2-F, b3a2/ b2a2_R，探针 b3a2/b2a2_Probe，检测内参基因 Abl 用引物为 abl_F，abl-R,探针 abl-Probe ;其中，b3a2-F: GATTTAAGCAGAGTTCAb2a2-F: TGTGTGAAACTCCAGACTGTb3a2/b2a2-R: TCCTTGGAGTTCCAACGAb3a2/b2a2-Probe: FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRAabI-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAGabl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述阳性对照品分别为含有b3a2、b2a2基因的溶液；所述阴性对照品为无b3a2和b2a2基因的溶液。
全文摘要
本发明公开了用于检测白血病BCR/ABL融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRDqPCRMIX、检测目的基因用上下游引物b3a2-F，b2a2-F，b3a2/b2a2-R，探针b3a2/b2a2-Probe，检测内参基因Abl用引物为abl-F，abl-R，探针abl-Probe。
文档编号G01N21/64GK102758006SQ20121012666
公开日2012年10月31日 申请日期2012年4月25日 优先权日2012年4月25日
发明者周晓犊, 徐建成, 方国伟, 王淑一 申请人:武汉艾迪康医学检验所有限公司