专利名称：J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组、检测方法和快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及J亚群禽白血病病毒基因的生物学鉴定，具体涉及一种J亚群 禽白血病病毒基因检测用引物组、检测方法和快速检测试剂盒。
背景技术：
目前对于禽白血病国内外尚未有效的疫苗和药物进行防制，控制该病
的主要手段是通过对鸡群定期进行禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)检测，及时淘汰带毒阳性鸡，通过频度检测来净化和清除鸡群中的 ALV。
根据病毒在不同遗传型鸡胚成纤维细胞上的宿主范围、不同病毒间的 干扰情况及病毒囊膜中和抗原特性，可将ALV分成A、 B、 C、 D、 E和J 亚群6亚群。A亚群和B亚群病毒为临床上常见的外源性病毒，E亚群为 极普遍的非致瘤性内源性病毒，而C、 D亚群病毒在临床上相对罕见，外 源性J亚群禽白血病病毒(ALV-J)则是最新被鉴定的新亚群。在各种外源 性ALV亚群中，目前以ALV-J亚群对我国养禽业的危害性最大，并出现了 髓细胞瘤型和血管瘤型等多种病理表现型，在临床表现上还容易与网状内 皮细胞增殖综合征、马立克氏病等肿瘤性疾病相混淆。
目前，国内外对于ALV-J的检测方法主要有ELISA、间接免疫荧光试 验、常规PCR等，其中以ELISA法在临床上应用最广，其主要原因是该法 操作相对简便，有商品化的检测试剂盒可以利用，国内外一些大型种禽场 多采用该方法进行种禽群的检测和净化。但是目前的ELISA检测试剂盒检测对象是ALV的群特异性抗原，由 于内源性ALV群特异性抗原的存在，故ELISA检测有一定的假阳性。ELISA 检测的另一个不足之处在于目前国内使用的禽白血病检测试剂盒均是国外 进口，其价格非常昂贵。
ALV-J常规PCR和间接免疫荧光试验也己经建立，但其操作复杂，对 设备仪器有专门的要求，适于在实验室条件下使用，而难以在基层推广利 用。鉴于我国养禽业正面临较大的禽白血病威胁，需要建立一种快速、简 便的ALV-J检测方法，以推动和促进我国养禽业对J亚群禽白血病的净化 与防控。
等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测 技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(LAMP)具有很多 的优越性，LAMP主要是利用4种不同的特异性引物(引物F3、引物B3、引 物FIP和引物BIP)识别靶基因的6个特定区段，在聚合酶和等温条件下高效、 快速、特异地扩增靶序列，扩增反应结束后，通常是采用染色剂对反应产物进 行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都选用具有链置换特性的DNA聚合酶， 如BstDNA聚合酶。对LAMP来说，4种特异性引物的设计是其关键所在。
LAMP因其自身的优点，现己被用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊 断，如严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、新城疫病毒(NDV)、 I型艾滋病病毒(HIV-1)的检测、分支杆菌属检测、腺病毒性结膜炎检测、 真菌检测等，现尚未见有LAMP用于ALV-J基因检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于环介导等温扩增技术检测J亚群禽白血病病毒基因的引物组。
本发明的另一个目的在于提供用上述引物组快速、高效、特异性检测禽白 血病病毒J亚群基因的检测方法。
本发明的另一个目的在于提供根据上述检测方法制备的快速检测试剂盒。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
一、 本发明的J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组，是基于环介导等温 扩增技术，根据已公开的J亚群禽白血病病毒基因序列，选取J亚群禽白血病 病毒基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别J亚群禽白血病病 毒基因的特异性引物组，通过LAMP来鉴定J亚群禽白血病病毒基因，该引 物组由如下四条引物组成
外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示； 其中，R为G或A， Y为T、 U或C。
二、 本发明的快速检测方法，是采用上述引物组，对待测样品DNA进行 环介导等温扩增反应，反应后进行琼脂糖凝胶电泳，阳性反应显示梯状带，或 向反应产物加显色剂，根据颜色变化判断反应结果。
上述环介导等温扩增反应参考教科书以及常用LAMP试剂盒中的反应体 系和反应条件均可实现本发明，具体操作时可选择如下反应条件和反应体系
LAMP反应体系(总25ul): FIP和BIP各lul， F3和B3各0.25ul， BSTDNA 聚合酶lul， 10X反应缓冲液2.5ul， dNTP 8ul，甜菜碱2ul，硫酸镁lul，待检DNA样品(含阳性对照品)lul，补水至25ul。上述各组分添加量为最佳
上述10X反应缓冲液是本领域技术人员进行Bst DNA聚合酶扩增反应 时常用的反应试剂，可采用试剂盒中搭配Bst DNA聚合酶的10X反应缓冲 液，通常可包括如下组分200mMpH8.8的Tris-HCl、 100mM的KCl、 100mM 的(NH4)2S04、 20mM的MgS04和l。/。 Triton X-100 (1 XTritonX-100是Triton X-100占反应液的体积百分比为1X)。
上述环介导等温扩增反应的反应条件可采用本领域人员操作环介导等温
扩增反应时的常规反应条件，优选恒温反应温度为63 65°C，恒温反应时间 为45 90min。
上述检测方法中，显色剂可选择SYBR Green I或EvaGreen其中一种常用 的荧光染料，优选SYBR Green I。
本发明的检测方法，应设置一个阳性对照和一个阴性对照，用来和 LAMP反应产物的检测结果进行比对，从而判断待测样品是否含有J亚群 禽白血病病毒基因。
LAMP反应结束后，对反应产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测和显色剂显 色反应检测
(1) 将反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，在阴阳性对照成立条件下，如果 LAMP产物呈现特征性梯状带，则为阳性，说明待测样品含有J亚群禽白血病 病毒基因；如果LAMP产物无特征性梯状带，则为阴性，说明待测样品不含有 J亚群禽白血病病毒基因。
(2) 将LAMP扩增产物中加入SYBRGrcen I荧光染料，在阴阳性对照成立条件下，如果反应管颜色发生变化，最终为黄色，则为阳性，说明待测样品含
有禽白血病病毒J亚群基因；如果反应管无颜色变化，呈现SYBR Green I荧 光染料的橘红色，则为阴性，说明待测样品不含有J亚群禽白血病病毒基因。
三、根据上述的检测方法，本发明还提供一种快速检测试剂盒，该试剂盒 包含
a. J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组外引物F3，其核苷酸序列如 SEQIDNO:l所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；内引物 FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中，R为G或A， Y为T、 U或C，内外引物的使用浓度均 为25pM/ul;
b. 阴阳性对照携带J亚群禽白血病病毒基因的质粒DNA作为阳性对 照，提供使用浓度为100ng/ul;去离子水作为阴性对照。
c. 显色剂可选择SYBR Green I或EvaGreen其中一种常用的荧光染料，优 选SYBRG證I。
该试剂盒操作时，只需要将待测样品DNA与上述检测用引物组进行常规 的LAMP反应，反应结束后加入显色剂，同时做阴阳性对照，在对照成立条 件下，如果反应产物的显色结果和阳性对照的显色结果一致，则为阳性，说明 待测样品中含有J亚群禽白血病病毒基因，如果反应产物的显色结果和阴性对 照的显色结果一致，则为阴性，说明待测样品中不含有J亚群禽白血病病毒基 因。 —
上述检测试剂盒还包含
a. Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段，提供使用浓度为8U/ul;b.反应液含有10X反应缓冲液、5M/L的甜菜碱、100mM/L的硫酸镁和 2.5mM/L的dNTP混合物，所述10X反应缓冲液、甜菜碱、硫酸镁和dNTP混合 物的体积比为2.5:2:1:8;所述10X反应缓冲液含有200mM pH 8.8的Tris-HCl、 1 OOmM KC1 、 1 OOmM (NH4)2S04、 20mM MgS04和1 % Triton X-100;
C.稳定剂可选择一种常用的稳定液，优选石蜡油，防止反应产物蒸发污 染环境。
25ul反应体系中上述各确定浓度组分的添加量FIP和BIP各lul， F3和 B3各0.25ul， BSTDNA聚合酶lul， IOX反应缓冲液2.5ul， dNTP混合物8ul， 甜菜碱2ul，硫酸镁lul，待检DNA样品(含阳性对照品)lul，补水至25ul。 混匀，本发明试剂盒中还可以在最后加入稳定剂，如石蜡油以防污染环境。 63。C水浴45 90min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1. 引物设计是LAMP技术的关键所在，对于引物设计有许多的要求，如各 个引物之间的距离、Tm值以及引物末端稳定性等，因此从200~300个碱基的 靶序列中设计四条符合要求的引物存在很大的难度。本发明根据靶基因序列设 计了一种J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组，能特异性识别靶序列上的六 个独立区域，在^W DNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在靶标DNA 区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构 的茎-环DNA混合物，由于LAMP技术只有在四条引物完全识别靶序列六个 结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增 反应的背景影响，大大改善了 J亚群禽白血病病毒基因检测的特异性；
2. 本发明的快速检测方法其检测灵敏度高，扩增模板仅需IO拷贝或更少，比常规PCR检测高1 2数量级；
3. 本发明的快速检测方法采用LAMP技术，不需通过温度循环变化来 扩增，从而免除变温过程耗费的时间，它在45 90min就能将几个拷贝的 靶基因高效扩增，且反应条件温和，不需精确的仪器以及凝胶成像系统，只 需一台普通水浴锅，也不需要特殊试剂，克服了传统PCR固有的检测时间长、 容易污染及检测成本高等缺点；
4. 本发明的快速检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增， 且产率高，而且采用显色反应对扩增产物进行检测，阴阳性结果显色差异显著， 可肉眼直接观察，易于判定，验证率高，更加明显可靠；
5. 本发明的快速检测试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低， 可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场快速检测。
图1为LAMP检测禽白血病病毒J亚群基因的特异性试验凝胶电泳图； 其中，M为DNA分子质量标准Marker， l为扬州Js-nt株，2为广东分离
样品株SCAU-0901， 3为广东分离样品株SCAU-CHN， 4为质粒阳性对照，
1 4均为J亚群，5为GD08株(A亚群)，6为CD08 (B亚群)，7为E1 (E亚群)，
8为E2 (E亚群)，9为E3 (E亚群)，NC为阴性对照。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发 明做任何限定。
实施例l J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组的制备 本实施例将NCBI中已公开的ALV-J原型株HPRS-103的前病毒全基因序列，与国内外15株已公开的ALV全基因序列进行同源性比较，从而确 定J亚群禽白血病病毒前病毒基因组的特异序列区，选择特异序列区大小
在300bp左右，根据该特异序列区设计出可用于LAMP反应的，对J亚群
禽白血病病毒基因具有高特异性的引物组
外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示； 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示； 其中，R为G或A， Y为T、 U或C。 实施例2 J亚群禽白血病病毒基因快速检测方法
本实施例选择样品为临床送检疑似禽白血病感染的样品，按照 OMEGA公司SQ Tissue组织DNA试剂盒抽提细胞DNA，具体操作过程 按照试剂盒说明书进行，制备DNA模板，-20°(:保存备用。
将实施例1设计的引物组送去上海英俊生物有限公司合成，然后将四 条引物分别稀释成25 pM/ul。
LAMP反应体系(总25ul): FIP和BIP各lul， F3和B3各0.25ul， BSTDNA聚合酶8U， 10X反应缓冲液2.5ul， dNTP8ul，甜菜碱2.0ul，硫 酸镁1.0ul，待检DNA样品(含阴阳性对照品)1.0ul，补水至25ul。混匀， 加石蜡油以防污染环境。63。C水浴锅水浴45min完成LAMP反应。
向上述反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，反应液颜色发生变 化，最终为黄色，说明本实施例样品含有禽白血病病毒J亚群基因。
本实施例中所用的甜菜碱、BstDNA聚合酶大片段、硫酸镁、dNTP和IOX反应缓冲液均为市售，或者LAMP试剂盒配有的。
实施例3 LAMP法检测J亚群禽白血病病毒基因的特异性试验 本实施选择已经鉴定具有J亚群禽白血病病毒基因的3个样品作为阳性
实验组扬州Js-nt株、广东分离样品株SCAU-0901和广东分离样品株
SCAU-C丽；
本实施例选择已经鉴定不具有禽白血病病毒J亚群基因的5个样品作为 阴性实验组GD08 (A亚群)、CD08 (B亚群)、El (E亚群)、E2 (E亚群) 和E3 (E亚群)。
同时本发明还设立两个阴阳性对照。
本发明对上述阳性实验组、阴性实验组和阴阳性对照分别进行LAMP扩 增，所用引物为实施例1制备所得引物组，LAMP反应体系为总体系25ul， 含有内引物FIP和BIP各l.Oul、外引物F3和B3各0.25ul、 Bst DNA聚合 酶1.0ul、 IOX反应缓冲液2.5ul、甜菜碱2.0ul、硫酸镁l.Oul、 dNTP 8ul、 DNA模板l.Oul和去离子水7.0ul;所述IOX反应缓冲液含有200mMpH8.8 的Tris-HCl、 100mM的KC1、 100mM的(NH4)2S04、 20mM的MgS04和1% Triton X-100 。 63 。C恒温反应45min。
将各LAMP扩增产物均分为两部分， 一部分进行琼脂糖凝胶电泳，如图 l所示，阳性样品的LAMP扩增结果(1、 2、 3、 4)中核酸电泳条带呈现梯 状分布，与理论结果相符，阴性对照未见特异性带出现，同样地阴性试验 组也均无特异性条带出现，由此说明本发明的LAMP检测用引物组以及检 测方法具有较高的特异性。
各LAMP扩增产物的另外一部分分别加入SYBR Green I荧光染料，结果发现阳性对照以及阳性实验组的反应液颜色均发生变化，最终为黄色; 而阴性对照组以及阴性实验组的反应液颜色均未发生变化，依然为橘红色。 颜色反应的结果和琼脂糖凝胶电泳检测结果保持一致，这进一步说明
本发明的LAMP检测方法准确性高，且颜色反应能准确快速地判断样品中
是否含有J亚群禽白血病病毒基因。
实施例4 J亚群禽白血病病毒基因检测试剂盒
本实施例J亚群禽白血病病毒基因检测试剂盒的制备
(1) 采用DNA合成仪合成如下序列引物，内外引物浓度均为25pM/ul。内 外引物置于一容器；
外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示； 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；
(2) 购置DNA聚合酶B^DNA聚合酶置于容器，提供使用浓度为8 IU/ul;
(3) 购置稳定液石蜡油，置于容器；
(4) 购置显色液SYBR Green I，置于容器；
(5) 购置阴阳性对照提取含J亚群禽白血病病毒基因的质粒DNA，置 于一容器,提供使用浓度为100ng/ul;去离子水作为阴性对照，置于一容器；
(6)反应液含有10X反应缓冲液、5M/L的甜菜碱、100mM/L的硫酸镁 禾口2.5mM/L的dNTP，所述10X反应缓冲液、甜菜碱、硫酸镁和dNTP的体积比 为2.5:2:1:8;所述10X反应缓冲液含有200mM pH 8.8的Tris-HCl、 100mM的 KC1、 100mM的(NH4)2S04、 20mM的MgS04和l。/。 Triton X-100;(7)将上述7个容器装成试剂盒，封装。
本实施例选择SCAU-0901株接种的DF-1细胞为样品，按照OMEGA公司 DNA试剂盒抽提细胞DNA，具体操作过程按照试剂盒说明书进行，制备 DNA模板。
采用上述制备所得试剂盒对样品中是否含有J亚群禽白血病病毒基因进
行快速检测
向反应管中加入FIP和BIP各lul， F3和B3各0.25ul， BST DNA聚合 酶lul， IOX反应缓冲液2.5ul， dNTP 8ul，甜菜碱2ul，硫酸镁lul，待检 DNA样品(含阳性对照品)lul，补水至25ul。混匀，加石蜡油以防污染环 境。63'C水浴锅水浴45min完成LAMP反应。
向上述反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，反应液颜色未发生 变化，依然为橘红色，阳性对照加入燃料后颜色发生变化，显示为黄色， 说明本实施例样品不含J亚群有禽白血病病毒基因。
14J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组、检测方法和快速检测试剂盒序列表 SEQUENCE LISTING
<110>华南农业大学
<120〉 J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组、检测方法和快速检测试剂盒
<130〉
〈160〉 4
<170〉 Patentln version 3. 5
<210> 1
<211> 19
<212〉 DNA <213>人工序列
<400> 1
ggraaggtga gcaagaagg 19
<210〉 2
<211〉 20
<212> DNA <213>人工序列
<400> 2
ygtcttattt gcccaggtga 20
<210〉 3
<2U> 39
<212> 腿 <213〉人工序列
〈400〉 3
rtaacctctc gayggcagca ctctaagaag aagccgcca 39
<210> 4
<211〉 40
<212> DNA <213〉人工序列
<400> 4
atttcygttg tcccaggggt gcccacacgt ttcctggttg 40
权利要求
1、一种J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组，其特征在于该引物组由如下四条引物组成外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示；内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO4所示；其中，R为G或A，Y为T、U或C。
2、 一种J亚群禽白血病病毒基因检测方法，其特征在于该方法是利用权利 要求1所述引物组通过环介导等温扩增反应来鉴定待测样品是否含有J亚群禽 白血病病毒特异基因。
3、 根据权利要求2所述方法，其特征在于所述环介导等温扩增反应的反应 条件为恒温反应温度为63 65匸，恒温反应时间为45 90min。
4、 根据权利要求2所述方法，其特征在于所述环介导等温扩增反应的反 应体系为总体系25ul，含有内引物FIP和BIP各l.Oul、外引物F3和B3 各0.25ul、 BstDNA聚合酶1.0ul、 10X反应缓冲液2.5ul、甜菜碱2.0ul、 硫酸镁1.0ul、 dNTP8ul、 DNA模板1.0ul和去离子水7.0ul;所述IOX反应 缓冲液含有200mM pH 8.8的Tris-HCl、 100mM的KC1、 100mM的 (NH4)2S04、 20mM的MgSCU和1% Triton X-100。
5、 一种J亚群禽白血病病毒基因快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含a.权利要求l所述J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组，FIP、 BIP、 F3和 B3，各25pMM;b. 阳性对照品携带J亚群禽白血病病毒基因的质粒DNA， 100ng/ul;c. 显色剂SYBR Green I或EvaGreen。
6、 根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于该试剂盒还包含a. Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段，8U/ul;b. 反应液含有10X反应缓冲液、5M/L的甜菜碱、100mM/L的硫酸镁和 2.5mM/L的dNTP，所述10X反应缓冲液、甜菜碱、硫酸镁和dNTP的体积比为 2.5:2:1:8;所述10X反应缓冲液含有200mM pH 8.8的Tris-HCl、 100mM的 KC1、 100mM的(NH4)2S04、 20mM的MgSO^ni% Triton X-100。
7、 根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于该试剂盒还包含液体石蜡油。
全文摘要
本发明公开一种J亚群禽白血病病毒基因检测用引物组、检测方法和快速检测试剂盒，该引物组由外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP这四条引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO1～4所示，其中，R为G或A，Y为T、U或C。本发明采用上述引物组，在优化的最佳体系下对待测样品DNA进行环介导等温扩增反应，阳性反应在琼脂糖凝胶电泳中显示梯状带，同时在反应产物中加入显色剂，阳性反应会发生明显的颜色变化。本发明的引物组和试剂盒均可高效高特异性地检测J亚群禽白血病病毒基因，在不足1h即可完成扩增反应，检测成本低、耗时短、产率高，特异性高，且阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。
文档编号C12Q1/68GK101586168SQ20091004039
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月19日 优先权日2009年6月19日
发明者涛 任, 明 廖, 张小桃, 曹伟胜, 罗开健 申请人:华南农业大学