专利名称：马尾松病死木中松材线虫的特异性检测引物、检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及松材线虫的基因学检测，具体涉及一种马尾松病死木 中松材线虫的特异性检测引物、检测方法及其应用。
背景技术：
松材线虫病是重要的检疫性病害，目前松材线虫病的全国发生面
积达8.7万hm2，累计枯死松树3500多万株，疫区疫木不仅不能正常利 用，而且影响其它农副产品和林产品的流通，造成直接经济损失25 亿元，间接经济损失达250亿元，生态环境、外贸出口和社会经济发 展受到严重影响，己被我国列入对内、对外的检疫对象。
关于松木中松材线虫的鉴定，目前常用的方法有松材线虫的形 态学鉴定方法、松材线虫蛋白质电泳方法、松材线虫酶联免疫吸附法、 松材线虫蛋白质印记法、松材线虫DNA杂交技术、松材线虫RAPD 技术和松材线虫巢式PCR鉴定等，但这些鉴定方法存在以下缺陷
1、松材线虫形态学鉴定简便易行，是现行线虫种类鉴定的常规 方法，但是线虫形态微小，需专业人士在显微镜下观察，分离结果难 确定，而且松材线虫组的变异伞滑刃线虫、锥尾伞滑刃线虫、科丽姆 伞滑刃线虫和拟松材线虫等具有和松材线虫相似的形态，这也使得形 态学鉴定比较困难，此外植物感病前期外观症状不明显，这也使得松 材线虫病早期诊断困难，发病的松木中并不是总能分离到松材线虫成 虫，且松材线虫多以幼虫形式存在，培养出成虫需要时间，这些都导致疑似病例得不到及时确诊，延误了最佳防治时期；
2、 蛋白质电泳分析是较早应用于线虫分类学研究的一项分子技
术，不少学者对松材线虫和拟松材线虫株系进行了同工酶差异的研 究，然而同工酶技术要求大量的样本才能获得清晰的电泳图谱，且蛋 白质的表达与环境以及线虫的生长发育阶段有关，到目前为止，尚未
有一种同工酶被公认为可以明确地区分松材线虫与拟松材线虫；
3、 DNA杂交技术虽然可以准确快速地鉴定松材线虫但是该技术 难度较大，费用高，且具有放射性危害，不利于大规模推广；
4、 随机扩增多态DNA技术(RAPD)虽然具有快速、简便、灵 敏且无需放射性同位素标记等优点，但是也存在图谱比较复杂，重复 性和可比性差等缺点，在鉴定松材线虫上存在一定的局限性。
PCR技术的应用，突破了DNA分子鉴定所受DNA量的限制，大 大提高了检测的灵敏度。Hoyer a/ (1998 Hoyer U, Burgermeister W， Braasch H. Identification of ^raqp/ze/ewc/2z^ species(Nematode, Aphelenchoididae) on the basic of amplified ribosomal DNA(ITS國RFLP). Nachrichtenblatt des Deutschen Pflanzenschutzdienstes, 1998, 50(11): 273-277)建立了区分5种线虫的ITS-PCR-RFLP技术，并成功地检测 了松材线虫和拟松材线虫，用单条活线虫建立了快速、灵敏的松材线 虫诊断方法；张立海(2001张立海，廖金铃，冯志新.松材线虫rDNA 的测序和PCRSSCP分析.植物病理学报，2001， 31 (1): 84-89)建立 的PCR-SSCP技术，可将松材线虫和拟松材线虫明显区分开。
这些PCR技术是在种级水平上区分松材线虫和拟松材线虫的简便快速方法，具有重复性和稳定性好、可靠性较高等优点，但是需要 将线虫从木头中分离出来之后，进行鉴定。
直接检测出松木中的松材线虫是人们一直在研究的课题。白钢等 (2005白钢，李海燕，马洪周等.疫木切面上松材线虫抗原的免疫学
检测方法.林业科学，2005， 41 (6) : 101-104)利用抗松材线虫血清， 建立在疫木切面上直接进行免疫组化染色检测松材线虫抗原的方法， 但是操作复杂，以及抗体特异性等因素给实际应用带来了一定的困 难；王延辉(2007王延辉.拟松材线虫致病性及检测技术研究.广州 华南农业大学，2007.30-36)通过设计组合外围通用引物和特异性引 物，运用巢式PCR技术从松树和线虫的混合DNA中，有效的检测出 松材线虫和拟松材线虫，但是步骤比较繁琐且增加许多不确定的因素, 尚处于研究开发阶段。
鉴于松材线虫病是我国的头号森林病害，而马尾松又在我国广泛 分布，因此对马尾松的松材线虫病的研究迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种马尾松病 死木中松材线虫的特异性检测引物，该引物对松材线虫具有高特异 性，可用于PCR方法检测马尾松病死木中的松材线虫。
本发明的另一个目的是提供一种利用上述特异性检测引物对马 尾松病死木中松材线虫进行高效快速PCR检测的方法。
本发明的另一个目的是提供上述特异性检测引物的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的本发明人通过对比松材线虫、拟松材线虫、马尾松松木的已公开 序列，设计并筛选出仅对马尾松病死木中松材线虫具有高特异性的引 物，通过PCP扩增检测马尾松病死木中松材线虫。
本发明的马尾松病死木中松材线虫的特异性检测引物，其上游引
物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物的核苷酸序列如 SEQIDNO: 2所示。
针对马尾松病死木中松材线虫种类多，将松材线虫从松木中分离 出来难度大，而且松木本身成分复杂，从而导致目的DNA模板制备 困难的现状，本发明还提供一种无需分离松材线虫，直接用马尾松病 死木制备DNA模板，可用于后期马尾松病死木中松材线虫的PCR检 测，该DNA模板的制备方法主要是采用WLB裂解液和蛋白酶K对 马尾松病死木进行两次裂解，具体包括如下步骤将马尾松病死木经 液氮研磨后加入WLB裂解液，水浴中完成温度循环95"C15min， 65'C2min，重复温度循环一次，然后加入蛋白酶K，水浴中65°Clh， 95°Cl5min，得到DNA裂解液，将该DNA裂解液纯化后则可作为 DNA模板用于后续的PCR扩增；所述WLB裂解液的配方为含有 2.5 mmol L" 二硫苏糖醇(DTT)、 1.125%吐温-20 (质量百分比)、 0.025%明胶(质量百分比)、125 mmol I/1 KC1、 25 mmol L" Tris-HCl (pH8.0)和3.75 mmol L-1MgCl2。
上述DNA模板的制备方法中，马尾松病死木和WLB裂解液以 及蛋白酶K的用量优选5mg的马尾松病死木，采用lOOpl 200pl WLB和8|il l(Hil蛋白酶K (20 mg'mr1)进行裂解；优选用量为5mg的马尾松病死木，采用200WWLB和10|_d蛋白酶K(20 mg，ml—1)
进行裂解。
上述DNA模板的制备方法中，所述纯化可采用纯化DNA常用 的3S柱。
一种马尾松病死木中松材线虫的特异性检测方法，包括如下步
骤
(1) 模板DNA制备采用上述DNA模板制备方法；
(2) 采用上述马尾松病死木中松材线虫的特异性检测引物，进行 常规PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过观察电 泳结果中的特异性片段，即可实现对马尾松病死木中松材线虫的检
上述步骤(2)中，为了提高PCR扩增效率，本发明对PCR扩 增反应条件进行了优化
a. PCR扩增退火温度的优化退火温度选择47°C 、47.6°C 、48.2°C 、 49.4°C、 50.8°C、 52.2°C、 53.7。C、 55.1°C、 56.6°C、 57.8°C、 58.4。C和 59'C的12个温度梯度，对松材线虫基因组DNA进行PCR扩增，实 验结果表明在52.2。C与53.7'C时的PCR产量最大，因此本发明优选 53"C作为PCR扩增的退火温度；
b. PCR扩增体系中镁离子浓度的优化在25pL的PCR扩增反应 体系中，采取1.5mmolL-1、 2.0mmolL"、 2.5mmolL"、 3.0mmolL"、 3.5 mmolL/1和4.0 mmolU1共6个梯度的镁离子浓度，对松材线虫基 因组DNA进行PCR扩增，实验结果表明当镁离子浓度为3.0 mmolL-1时PCR扩增产物的产量最大，因此本发明的PCR扩增反应体系中镁
离子浓度优选3.0 mmolL"。
上述步骤(2)中，PCR扩增结束后，将扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳，紫外灯下观察电泳结果，若在403处出现特异性条带，则为 阳性结果，说明待测样品中，反之则为阴性结果。
本发明的马尾松病死木中松材线虫的特异性检测引物可制备成 快速检测试剂盒，从而使得马尾松病死木中松材线虫的检测更加快 速、便利。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1. 本发明的马尾松病死木中松材线虫的特异性检测引物对马尾 松病死木中的松材线虫具有高度的特异性，能够将松材线虫与松材线 虫近缘的线虫区分开，能将松材线虫与马尾松松木、马尾松松木中其 他12种线虫区分开，还能将松材线虫与马尾松松木中常见的真菌和 细菌区别开来；
2. 由于松材线虫病的复杂性，如何快速、有效地从病木中检测 出松材线虫， 一直是松材线虫病鉴定的难点，本发明提供一种无需从 病木中分离松材线虫，直接对病木中松材线虫进行PCR扩增的方法， 节省了分离时间，提高了检测效率；
3. 对PCR技术来说，引物的涉及和模板的质量一直是影响PCR 成功的两大关键因素，本发明不但涉及得到针对马尾松病死木中的松 材线虫具有高度特异性的引物，还提供了一种从马尾松病死木中制备 PCR所需DNA模板的方法，该方法是直接将病木进行液氮研磨后，经过WLB和蛋白酶K的两次裂解，用3S柱纯化后，得到了可用于 PCR扩增的DNA模板，扩增效率达到100%，不但DNA模板的制备 方法比现有方法简单，而且模板的质量也有很大提高；
4. 本发明提供的检测方法简单高效，通过特异性检测引物，通过 简单的PCR，可方便地检测马尾松病死木中的松材线虫；
5. 采用本发明的特异性检测引物可制备相应检测试剂盒，从而使 得检测更加简单程序化，成本低、方法特异性强，敏感性高，结果判 定客观，准确性高，有利于大规模推广；
6. 本发明对PCR扩增条件进行了优化，选择退火温度为53°C， MgCl2的浓度为3.0 mmolL—1，从而可提高整个PCR反应的特异性， 取得更好的检测效果。
图1为松材线虫、马尾松松木和拟松材线虫的特异性检测电泳
其中，M为Marker, 1 3为松材线虫，4~6为拟松材线虫，7~8 为马尾松松木；
图2为松材线虫与马尾松松木中其他12种线虫的特异性检测电 泳其中，M为Marker, 1为松材线虫，2为拟松材线虫 ， 3为奇异伞真滑刃线虫(及a&mms)， 4为小角伞 滑刃线虫(及coweo/w)， 5为来氏伞滑刃线虫(及/eo"/)， 6为湖南伞 滑刃线虫(5./mwa"e"w;s)， 7为畸剌伞滑刃线虫(及teratos^^/ani)，8为红松滑刃线虫Uj^e/ewc/2o/(i^ mw'mosO 9为斯坦纳长尾滑刃线 虫(5Wm/ra他/"en')， 10为小蓬线虫(Z)一e"c/m户arras)， 11为剑 尾齿杆双胃线虫(CWor/za6却/oga他r x一ocaMcfoto ) ， 12为小杆线虫 (i /2aZ^///6^ w)， 13为寄生小杆属线虫(尸arawYoAaZ^/泡w)， CK 为阴性对照ddH20;
图3为松材线虫与马尾松松木中常见真菌的特异性检测电泳图； 其中，M为Marker, 1为木霉属真菌(7Hc/zo&rma spp. )， 2为 青霉属真菌(i^"/cz'〃/wm spp. )， 3为炭疽病属真菌(Co〃etofn'c/2wm spp.)， 4为拟盘多毛孢属(Pasto/o/Zo/w^ w)， ck+为松材线虫，ck-为ddH20;
图4为松材线虫与马尾松松木中常见细菌的特异性检测电泳图； 其中，M为DNAMaker ， 1为蜡质芽孢杆菌(Sac/〃w;y cewus)， 2为解淀粉芽孢杆菌(5ac/肠調少/。/—咖c/冊)，.3为炭疽芽孢杆菌 (5ac/〃ws aw/Zzracz^), 4为矢旦矢豆芽f包杆菌(5rev/Z ac/〃ws 6rev/s)， 5为 苏云金芽孢杆菌(5acZ〃ws AwW"g/era^ ) ， 6为荧光假单孢 (i^ewt/om^7770"as^/7worasce"/)， 7为枯草芽孢木干菌(5ac/〃z^ sw6/77/s)， 8为肠杆菌属(观)，9为施氏葡萄球菌(5"鄉/^/ococ譜 sa/ raj: /2,'cMS)， 10为微杆菌(M/cra6acfeWww ms7'他ra)， ck+为松材 线虫，ck-为ddH20;
图5为DNA模板制备过程中不同配比裂解液裂解扩增效果电泳
其中，M为Marker, 1~4为WLB裂解液32|iL与蛋白酶K4)iL，5~8为WLB 100^iL与蛋白酶K8j^L，9 12为WLB 200pL与蛋白酶K
L;
图6为不同退火温度对PCR扩增影响电泳其中，M为Marker, 1 12分别是退火温度为47°C、 47.6°C、
48.2°C、 49.4°C、 50.8°C、 52.2°C、 53.7°C、 55.1。C、 56.6°C、 57.8°C、
58.4。C和59°C;
图7为镁离子浓度对PCR扩增体系的影响电泳其中，M为Marker, 1 6分别是镁离子浓度为1.5mmolL'1、 2.0
mmo11/1、 2.5 mmo11/1、 3.0 mmolL誦1、 3.5 mmolL"禾口 4.0 mmo11/1。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地描述，但具体实施例并 不对本发明做任何限定。
实施例l本发明引物特异性试验
1. 制备引物通过基因合成公司合成马尾松病死木中松材线虫的
特异性检测引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: l所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示。引物放在-20冰箱中 保存。
2. PCR扩增
PCR扩增反应体系10xPCRbuffer 2.5^1 (Mg2+ free), dNTP(2.5 mmol-I/1) 2pl， Mg2+ (25mmol'L1) 3^1，弓I物P1 (10(iM)禾口 P2 (10)iM)各ljil， TaqDNA聚合酶5U'y10.125^11，模板DNA2pl， 灭菌双蒸水补充至总体积25^1。
12PCR扩增反应条件94"C预变性3min; 94。C变性45s， 53'C退火 30s， 72。C延伸lmin， 35个循环后，最后72'C延伸5min。
3. 马尾松病松木制备DNA模板
将采回实验室的病木，分割成底面积为0.5cmx0.5cm、厚度为 0.02cm的薄木片，放入灭菌的1.5mL的离心管中，液氮中做稍许研 磨，后加入200iiLWLB(2.5mmo1 'I/1 DTT， 1.125% Tween20， 0.025 % Gelatin， 125 mmol L-1 KC1， 25 mmol I/1 Tris-HCl (pH 8.0)， 3.75mmo1 L"MgCl2 )，然后在水浴中完成温度循环95。Cl5min， 65。C2min，两个循环，加入10pL蛋白酶K (20 mg'mL")，后65。Clh， 95。C15min。裂解后的DNA提取液经过3S柱进行纯化，吸取2pL做 模板。
4. 松材线虫、马尾松松木和拟松材线虫的特异性检测 将用现有方法已经鉴定的，松材线虫、拟松材线虫和健康马尾松
松木作为检测原料，分别制备后续PCR扩增所需模板。
采用上述合成的特异性引物(其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示；其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示)， 按照上述PCR扩增体系和反应条件，分别对三种材料的DNA进行 PCR扩增，扩增产物一起跑琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察电泳结果， 如图1所示。
从图1中可以看出，在约500bp处出现特异性条带(403bp)而 其余泳道均未出现特异性条带，由此说明本发明的特异性引物可以将 松材线虫与拟松材线虫以及马尾松松木区分开来。5. 松材线虫与马尾松松木中其他12种线虫的特异性检测 选择已知的马尾松松木中12种线虫拟松材线虫(及聽m 加^
、奇异伞真滑刃线虫(及Wwrara)、小角伞滑刃线虫(及comeo/w s)、来氏伞滑刃线虫(及/eow')、湖南伞滑刃线虫(及/m"fl"m^)、畸 刺伞滑刃线虫(及terato^/cw/an^)、红松滑刃线虫(v4j^e/e"c/zoW^ r m/"cw')、斯坦纳长尾滑刃线虫(&z'm^ra We/wen')、小莲线虫(D〖&/ 户arvws)、..金U尾齿禾干双胃线虫(CWw/^Znii^/ogaWer xi(p/zocaw(i a^s)、小杆线虫(i /^6o^Wa 和寄生小杆属线虫(Paras/tor/za6d 他《sp)。
采用上述合成的特异性引物(其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示；其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示)， 按照上述PCR扩增体系和反应条件，分别对松材线虫以及上述12种 线虫进行PCR扩增，扩增产物一起跑琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观 察电泳结果，如图2所示。
从图2中可以看出，只有松材线虫出现特异性条带(403bp)，而 其余12种线虫以及阴性对照都没有出现特异性条带，由此说明本发 明的特异性引物可以将松材线虫与马尾松木中其余12种常见线虫区 分开来。
6. 松材线虫与马尾松松木中常见真菌、细菌的特异性检测 选择己知的马尾松病木中常见的木霉属真菌、青霉属真菌、炭疽
病属真菌和拟盘多毛孢属真菌等4种真菌，以及蜡质芽孢杆菌、解淀 粉芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、荧光假单孢、枯草芽孢杆菌、肠杆菌属、施氏葡萄球菌和微杆菌等10种 细菌。
采用上述合成的特异性引物(其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示；其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示)， 按照上述PCR扩增体系和反应条件，分别对松材线虫以及上述木霉 属真菌、青霉属真菌、炭疽病属真菌和拟盘多毛孢属真菌等4种真菌 进行PCR扩增，扩增产物一起跑琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察电 泳结果，如图3所示。
采用上述合成的特异性引物(其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示；其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示)， 按照上述PCR扩增体系和反应条件，分别对松材线虫以及上述蜡质 芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、苏云金 芽孢杆菌、荧光假单孢、枯草芽孢杆菌、肠杆菌属、施氏葡萄球菌 和微杆菌等IO种细菌进行PCR扩增，扩增产物一起跑琼脂糖凝胶电 泳，紫外光下观察电泳结果，如图4所示。
从图3和图4中可以看出，只有松材线虫出现特异性条带 (403bp)，而实验中的4种真菌和10种细菌以及阴性对照都没有出 现特异性条带，由此说明本发明的特异性引物可以将松材线虫与马尾 松木常见的真菌、细菌区分开来。
由本实施例的三个特异性检测试验可以看出，本发明的马尾松病 死木中松材线虫的特异性检测引物具有很高的特异性，能够将松材线 虫和马尾松木、马尾松木中常见的其他线虫以及真菌、细菌区分开来，从而保证了本发明检测方法的准确性和特异性。
实施例2马尾松病死木制备DNA模板
本实施例对马尾松病死木制备DNA模板时，所需要的WLB和 蛋白酶K两种裂解液的量进行一个优化。
采用马尾松病死木制备DNA模板，若采用2mg的马尾松病死木 较难扩增出目的片段，因此采用5mg的马尾松病死木进行试验。
制备WLB裂解液，配方为含有2.5 mmol 二硫苏糖醇、1.125 %吐温-20、 0.025%明胶、125醒olL"KCl、 25 mmol L" Tris画HCl (pH8.0)和3.75mmolL"MgCl2。
蛋白酶K为市售。
本实施例采取三种裂解液(O WLB裂解液32pL与蛋白酶K 4jiL; (2) WLB 100^iL与蛋白酶K8^iL; (3) WLB 200pL与蛋白酶K 10pL，将这三种裂解液分别进行如下DNA模板制备的操作
将5mg的马尾松病死木放入灭菌的1.5mL的离心管中，液氮中 做稍许研磨后，加入WLB水浴中完成温度循环95'C15min， 65°C2min，两个循环，然后加入蛋白酶K，水浴中65°Clh， 95'Cl5min， 得到DNA裂解液，再经3S柱纯化后得到所需DNA模板。
将所得到的三种DNA模板，采用实施例1的特异性引物，PCR 扩增体系和扩增条件进行后续的PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳检测，电泳结果如图5所示，裂解液配方(2)和(3)都能取 得较好的效果，其中以配方(3)最好，因此本发明在制备DNA模板 时，采用100ji1 200ji1WLB和8^d 10pl蛋白酶K (20mgTiir1)进行裂解，优选200pl WLB和10^1蛋白酶K (20mg'mr1)。 实施例3 PCR扩增条件的优化
本实施例对PCR扩增中退火温度和镁离子浓度进行优化。 l.退火温度的优化
以47。C、47.6。C、48.2。C、49.4。C、 50.8°C、 52.2°C、 53TC、 55.1°C、 56.6°C、 57.8°C、 58.4。C和59。C为温度梯度，对松材线虫基因组DNA 进行PCR扩增，PCR扩增结果如图6所示，这12个测试的温度都能 扩增出清晰的条带，其中以52.2"C与53.7'C时的PCR产量最大，因 此本发明的退火温度优选53 °C 。 2.镁离子的优化
在25pL的PCR扩增反应体系中，采取1.5mmolL'1、 2.0mmolL'1、 2.5 mmolL-1、 3.0 mmolL"、 3.5 mmolU1和4.0 mmolL-1共6个梯度的 镁离子浓度，对松材线虫基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增结果 如图7所示，6个梯度的镁离子浓度均有扩增条带，其中，以镁离子 浓度为3.0 mmolL'1时产量最大，因此本发明的镁离子浓度优选3.0 mmolL-1 。
17马尾松病死木中松材线虫的特异性检测引物、检测方法及其应用序列表 SEQUENCE LISTING
<110>华南农业大学
<120>马尾松病死木中松材线虫的特异性检测引物、检测方法及其应用
<130>
<160> 2
<170> Patentln version 3. 5
<210> 1
〈211〉 23
<212〉 DNA <213>人工序列
<400〉 1
ctacgtgctg ttgttgagtt ggc 23
<210> 2
<211> 20
<212> 腿 <213>人工序列
<400> 2
tggtgcctaa cattgcgcga 20
权利要求
1、一种马尾松病死木中松材线虫的特异性检测引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
2、 一种马尾松病死木中松材线虫的检测方法，其特征在于该方 法包括如下步骤(1) 将马尾松病死木经液氮研磨后加入WLB裂解液，水浴中95 'C15min， 65"C2min进行温度循环，重复一次温度循环后加入蛋白酶 K，水浴中65"Clh， 95°Cl5min，得到DNA裂解液，将该DNA裂解 液纯化后则制备得到DNA模板；所述WLB裂解液含有2.5 mmolL" 二硫苏糖醇、1.125 %吐温-20、0.025 %明胶、125 mmolL" KC1、25 mmol L" pH 8.0的Tris-HCl和3.75 mmol L-1 MgCl2;(2) 用权利要求1所述特异性检测引物采用常规PCR技术进行扩增；(3) 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外光下观察特异性扩增条 带，即可实现马尾松病死木中松材线虫的检测。
3、 根据权利要求2所述检测方法，其特征在于所述步骤(l)中， 马尾松病死木、WLB裂解液和蛋白酶K的用量为5mg的马尾松病 死木采用lOOjil ~200^il的WLB裂解液和8pl l(^l蛋白酶K进行裂 解；所述蛋白酶K的浓度为20mg'mr1。
4、 根据权利要求3所述检测方法，其特征在于所述马尾松病死 木、WLB裂解液和蛋白酶K的用量为5mg的马尾松病死木采用200pl的WLB和lO(il蛋白酶K进行裂解；所述蛋白酶K的浓度为20 mg.mri 。
5、 根据权利要求2所述检测方法，其特征在于所述步骤(1)中， DNA裂解液的纯化采用3S柱。
6、 根据权利要求2所述检测方法，其特征在于所述步骤(2)中， PCR扩增的退火温度为47°C~59°C。
7、 根据权利要求6所述检测方法，其特征在于所述PCR扩增的 退火温度为53'C。.
8、 根据权利要求2所述检测方法，其特征在于所述步骤(2)中， PCR扩增体系中镁离子的浓度为1.5mmolL'1 4.0 mmolL—1。
9、 根据权利要求8所述检测方法，其特征在于所述PCR扩增体 系中镁离子的浓度为3.0mmolU1。
10、 权利要求1所述马尾松病死木中松材线虫的特异性检测引物 在制备马尾松病死木中松材线虫的快速检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开一种马尾松病死木中松材线虫的特异性检测引物、检测方法及其应用，该特异性检测引物其上游引物的核苷酸序列如SEQID NO1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。本发明的引物能将松材线虫与马尾松松木、马尾松木中其他12种线虫，以及马尾松木中常见的4种真菌和10种细菌区别开来。本发明还提供一种无需从病木中分离松材线虫，直接对病木中松材线虫进行PCR扩增的方法，将病木液氮研磨后，经WLB和蛋白酶K两次裂解，纯化后得到PCR扩增用DNA模板，扩增效率达到100％，节省了分离时间，提高了检测效率。本发明的检测方法简单高效，准确性高、特异性高，可制备成试剂盒进行大规模推广。
文档编号C12N15/11GK101586160SQ20091004039
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月19日 优先权日2009年6月19日
发明者孔祥超, 朱孝伟, 王新荣, 纪春艳, 胡月清, 贾文慧, 钟填奎 申请人:华南农业大学