专利名称：一种锁核苷酸(lna)增敏的eb病毒荧光定量pcr试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种锁核苷酸(LNA)增敏的EB病毒荧光定 量PCR检测试剂盒及其检测方法和应用，适用于各种组织、细胞、血液及其它体液中的EB病 毒核酸的定量检测。
背景技术：
EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)是一种重要的感染人类的DNA病毒。EBV是 DNA病毒，属疱疹病毒γ亚科，与单纯疱疹病毒I型(HSV-I)和II型(HSV-2)、巨细胞病 毒(CMV)、水痘-带疱疹病毒(VZV)和近年发现的人类第6型疱疹病毒同属人类疱疹病毒 组，相互间在形态上难以区分，增殖方式也类似。EBV基因组全部核苷酸序列的测定已经完 成。该基因组是一双链DNA分子，由170，000 175，000个碱基对(170 175kb)组成，在 细胞内可有两种存在方式，即以线性分子的形式在一定部位插入细胞染色体DNA (称为“整 合”)，或以环状分子的形式游离于细胞DNA之外(称为“游离体” episome)，类似于细菌的 质粒。这两种形式可单独存在或并存，但一般而言，若细胞内有完整的病毒，其基因组多为 整合型；若病毒潜伏，则其基因组多为游离型。基因组两端有末端重复序列(TR)，可相互连 接形成环状游离体。基因组内部包括4个内部重复序列(IRl IR4)和5个独特区(Ul U5)。与EBV感染有关的疾病很多，重要的有传染性单核细胞增多症、NPC(鼻咽癌) 和鼻咽以外(例如肺、腮腺、鼻腔鼻窦、扁桃体、胃等处)的淋巴上皮瘤样癌、鼻型结外NK/ T细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、Burkitt淋巴瘤、一些肠病型T细胞淋巴瘤、一些经 典Hodgkin淋巴瘤、一些外周T细胞和B细胞淋巴瘤以及器官移植后的淋巴组织增生症 (PTLD)等等，特别是与鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)有密切关系。随着近代 分子生物学的发展，对EBV感染的诊断，从原理到方法都得到了突飞猛进的发展。对病原的 测定(包括病毒分离、DNA杂交及PCR检测)，由于操作要求高、设备及试剂昂贵等，应用受 到限制，目前EBV感染的血清学检测指标主要包括血清EB病毒VCA/IgA，EA/IgA等抗体半 定量分析，是目前NPC筛查最常用的手段。但是上述检测手段灵敏度和特异性低，且不能对 病人体内EB病毒感染的程度进行定量检测。定量检测患者血清或体液中EB病毒DNA拷贝 数，能够准确反应患者EB病毒感染的严重程度，也能反映EBV相关肿瘤患者体内瘤荷，对于 肿瘤诊断与临床分期，疗效评价、病人预后等有较好的临床意义。NPC是一种具有特殊临床病理特征的恶性肿瘤，对放射治疗敏感、易发生复发和远 处转移等。放疗是NPC首选治疗方法，但治疗后完全缓解患者仍有约40% 50%出现远处 转移和局部复发而导致治疗失败。目前临床监测NPC患者肿瘤转移、复发的手段主要依靠 常规体检，间接鼻咽纤维镜、胸片(或胸部CT)、腹部B超(或腹部CT)、全身骨ECT等物理 和影像学检查，但存在敏感性和特异性不足，检查费用昂贵，发现不及时，原发性肿瘤和鼻 咽转移性肿瘤鉴别困难等问题，因而寻找可以监测NPC治疗后转移、复发的标志物有现实
3的临床意义。传统上，用含病毒淋巴细胞涂片的间接免疫荧光法检测EB病毒特异性抗体，目前 国外还在使用，主要是检测VCA-IgA抗体和EA-IgA抗体，需使用荧光显微镜。中国自80 年代起，推广使用了免疫酶法(EIA法)检测VCA-IgA抗体和EA-IgA抗体，使基层实验室 仅用普通显微镜就能开展检测工作，这是目前国内的常用方法。这些传统方法至今仍在大 多数实验室使用。VCA-IgA检测通常被用于筛查以排除NPC的诊断，灵敏度> 90%而特异 性< 70% ；相反的，EA-IgA检测目前被用于NPC的确定性检测，特异性> 90%而灵敏度 < 80%，两者在NPC可疑病例诊断时有互补作用。对于NPC疑似病人，VCA-IgA其阴性预 测率达98%，可作为排除NPC的指标，仅有< 10%的假阴性率；VCA-IgA阳性结果由于有> 30%的假阳性率，故不作为充分的NPC预测，因此，阳性样品通常用EA-IgA作进一步检测， 两种试验阳性的结果可作为NPC结果预测，而VCA-IgA单独阳性、EA-IgA阴性结果判定为 可疑诊断。因此，在血清学诊断NPC可疑病例时，VCA-IgA检测通常被用于筛查以排除NPC 的诊断；而EA-IgA被用于预测NPC的确定性检测。在人群筛查中，VCA-IgA阳性结果的健 康个体与患NPC风险的增加相关，而EA-IgA阳性结果或多种EBV抗体阳性的风险水平比前 者更高。EBV血清学诊断已用于NPC高危人群的筛查和对NPC可疑病例的诊断。它利用NPC 的一个特征，即患者多种EBV抗体的水平较非患者高。根据从70年代后期以来的研究结果， VCA-IgA和EA-IgA特异性的荧光免疫或酶免疫检测方法被用于满足不同的需要VCA_IgA 检测有很高的灵敏度，但缺乏特异性，通常被用于筛查以排除NPC的诊断；相反的，EA-IgA 检测特异性很高，但缺乏灵敏度，目前被用于NPC的确定性检测，两者在NPC可疑病例诊断 时有互补作用。随着90年代分子生物学的发展，出现了采用不同EBV基因工程重组抗原的 酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂，这些检测方法各自有许多内在的优点，而且在结果判 定的客观性上大大优于传统方法。最近，通过不同抗原的联合检测，其诊断性能可进一步提 高。而EBV-DNA PCR检测试剂一般用于预后判断，有希望成为监测NPC治疗后转移、复发的 指标，因其灵敏度低，不适用于早期诊断。目前，EBV血清学检测指标主要是检测VCA-IgA抗 体和EA-IgA抗体，但由于这两种抗体在体内的半衰期较长，即使体内EBV被清除，仍有较长 时间存在较高浓度，尚无证据显示可作为监测NPC治疗后转移、复发的指标。上述方法大多数在实验室水平上与传统方法作比较，但只有很少的研究评估它们 在实际临床和应用领域中的性能。Chan等研究表明EBNAl IgA ELISA和zta IgG ELISA 单独使用时，比传统方法的VCA-IgA有略低的敏感性，但特异性更高，而比EA-IgA有略低的 特异性，但敏感性更高；然而，当两种新试验联合检测时，比传统方法能达到更可靠的血清 学诊断NPC的性能其阴性预测率达99. 1%，可作为NPC排除的有力指标，而阳性预测率达 87%,可作为NPC预测的有力指标。其综合性能超过VCA-IgA和EA-IgA联合检测时的相应 预测值96%和89%。Cheng等进行的一项研究评估了新方法在人群筛查中的性能，研究表 明^NA IIgA,EBNA IIgG ELISA和zta IgG ELISA结合在一起检测能用于NPC高发区健康 人群筛查的风险评估，检测结果能把健康人群分为高风险、中度风险和低风险几类高风险 人群占0.4%，其风险系数(RR) = 138 ；中度风险人群约占15%，其风险系数(RR) = 4 10 ；低风险人群的风险系数(RR) = 0. 3 0. 009。上述两个研究证实新方法联合检测比单 独使用效果更佳。
近年来有研究证实可以在NPC患者血清/血浆中检测到肿瘤细胞的EBVDNA， Mutirangura等首次报导用巢式RT-PCR方法，在31 % NPC患者的血浆中检测到EBV DNA0 国内多篇文献报道，采用实时定量PCR技术，利用一对特异性引物和特异性荧光探针，结合 PCR技术和荧光检测技术，实现对EBV病毒的定量检测。鼻咽癌病人血清中EBV-DNA的拷贝 数与肿瘤负荷、转移、治疗反应等相关；血浆EBV-DNA水平是独立于鼻咽癌 M分期的，可以 敏感预测病人生存预后的分子标志物；该标志物的检测目前已经常规应用鼻咽癌病人的诊 断、疗效检测和预后，有希望成为监测NPC治疗后转移、复发的指标。因此，研制更加敏感的 EBV感染的血清学定量检测诊断试剂乃当务之急。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明的一个目的在于提供一种能快速、高敏感度的检测 血清、血浆EBV-DNA的荧光定量PCR检测试剂盒。本发明的一种锁核苷酸(LNA)增敏的EB 病毒荧光定量PCR试剂盒，包括LNA (锁核苷酸)-TaqMan荧光定量反应液、阳性对照样品， 其中，LNA-TaqMan荧光定量反应液包括正向引物5，-AATTTT TTC TGC TAA GCC CAA CA-3，；反向引物5，-ACGGGT GGG TGT GTG TAG TGT-3，；LNA-TanMan 荧光探针5，-FAM-CCA CCA CAC CCA GGC-MGB3，。所述阳性对照样品为包含所述EB病毒基因组片段的质粒DNA。本发明的第二个目的在于提供一种锁核苷酸(LNA)增敏的EB病毒荧光定量PCR 检测方法，包括如下步骤(1)荧光定量核酸扩增反应体系的配制在反应管中加入正向引物、反向引物和 LNA-TanMan荧光探针、模板DNA、2 X Taqman通用PCR反应混合液，增加ddH20至反应体系为 15 μ 1，混合均勻；(2)荧光定量核酸扩增将所述步骤(1)得到的混合溶液置于荧光定量反应仪上 进行反应；(3)反应结束后，将模板DNA的循环阈值C(t)与标准曲线对照，得到模板DNA中的 EB基因片段拷贝的浓度。所述的正向引物、反向引物和LNA-TanMan荧光探针的序列如下正向引物5，-AATTTT TTC TGC TAA GCC CAA CA-3，；反向引物5，-ACGGGT GGG TGT GTG TAG TGT-3'；LNA-TanMan 荧光探针5，-FAM-CCA CCA CAC CCA GGC-MGB3，。所述的正向引物、反向引物和LNA-TanMan荧光探针的终浓度均为20 μ Μ。上述的LNA-TanMan荧光探针中5'端标记荧光报告基团FAM，3 ‘端标记荧光淬灭 基团BHQl。反应条件为95°C热启动8分钟预变性后；进入扩增循环95°C 30秒，55°C 45秒 循环40次。上述的锁核苷酸(LNA)增敏的EB病毒荧光定量PCR试剂盒在EB病毒检测、鼻咽 癌诊断治疗、预后判断、监测鼻咽癌治疗后复发和转移方面的应用。本发明以EB病毒的BamHI-W片段为目标检测序列，采用LNA技术合成覆盖EBV基 因BamHI-W核酸片段的锁核苷酸序列探针，结合荧光定量PCR技术，研制一种快速、高度灵敏的检测EBV基因荧光定量PCR试剂盒。与血清学检测EB病毒VCA核EA抗体以及与常规荧光定量PCR检测EBV-DNA基因 比较，本发明的锁核苷酸(LNA)增敏的EB病毒荧光定量PCR试剂盒及其检测方法适用于各 种组织、细胞、血液及其它体液中的EB病毒核酸的定量检测，且具有以下优势1、高度灵敏灵敏度达10个基因拷贝数每毫升检测样品，10倍优于普通荧光定量 PCR 法。2、检测时间短，从标本送检到得出结果可在12个小时以内完成。3、操作过程简单，并且从PCR反应开始，就是在封闭的体系中完成扩增和实时测 定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了结果偏差的几率(比较如下所示)。4、本发明的试剂盒和方法对标本DNA获取的质量要求较低，无论是血清、血浆、石 蜡组织还是新鲜组织，都能取得理想的检测结果。5、检测的样本量大，一次实验最多可检测384例。6、安全整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。本发明的新一代EBV-DNA荧光定量PCR检测试剂盒，利用目前最先进的锁核苷酸 技术，使EBV-DNA的定量检测灵敏度较普通的定量PCR提高10-100倍，一方面，可以用于鼻 咽癌诊断治疗、预后判断、监测鼻咽癌治疗后复发和转移等临床应用；另一方面可以通过动 态检测患者体内EBV-DNA水平，评价病人体内EBV感染的程度，从而评价病人免疫力变化动 态。在本发明中提供的两端都标有荧光发光基团的特异性荧光探针，在探针完整时， 两基团在空间结构上距离相互靠近，5'端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移 (FRET)而被3'端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与突变后的 模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延 伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5' -3'外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基 团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光 就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片 段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。 因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做突变样本具体含量的定量检测。
图1是本发明的荧光定量PCR试剂盒检测鼻咽癌病人血浆EBV-DNA的重复性实验 的结果图；图2为本发明的EBV-DNA荧光定量PCR试剂盒检测检测鼻咽癌病人血浆EBV-DNA 浓度的一个优选实施例的结果图。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。实施例1 荧光定量PCR试剂盒检测鼻咽癌病人血浆EBV-DNA的重复性实验本发明的锁核苷酸(LNA)增敏的EB病毒荧光定量PCR试剂盒包括LNA(锁核苷 酸)-TaqMan荧光定量反应液、阳性对照样品，其中，LNA-TaqMan荧光定量反应液包括
正向引物5，-AATTTT TTC TGC TAA GCC CAA CA-3，；反向引物5，-ACGGGT GGG TGT GTG TAG TGT-3，；LNA-TanMan 荧光探针5，-FAM-CCA CCA CAC CCA GGC-MGB3，。阳性对照样品为包含所述EB病毒基因组片段的质粒DNA。应用该试剂盒检测EBV-DNA，按如下步骤进行(1)荧光定量核酸扩增反应体系的配制在反应管中加入正向引物 0. 15 μ 1 (20 μ Μ)、反向引物 0. 15 μ 1 (20 μ Μ)和 LNA-TanMan 荧光探针 0. 2 μ 1 (20 μ Μ)、模板 DNA2. 5 μ 1 (50ng/ μ 1) >2 X Taqman 通用 PCR 反应t昆合液(2氺Taqman universalPCR Master Mix，购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，增加ddH20至反应体系为15 μ 1，混合均勻；(2)荧光定量核酸扩增将所述步骤(1)得到的混合溶液置于荧光定量ΑΒΙ7900 检测仪上进行反应；反应条件:95°C 8分钟预变性；95°C 30秒，55°C 45秒，做40个循环。阳 性模板为EBV BamHl-W片段质粒克隆而成，并梯度稀释成1 X 107、1 X IO6、1 X IO5和1 X IO4 拷贝/μ 1，每次PCR反应各梯度阳性模板均与样本同时进行扩增，以绘制阳性标准曲线对 样本定量(见图1Α)。每次PCR反应均同时做多管阴性对照和空白对照。图IA示EBV-DNA标准品扩增曲线，可以看到不同浓度标准品(分别为IX 107， 1Χ106，1Χ105，1Χ104拷贝/毫升)呈平行的标准S形扩增曲线，其结果可靠性达到 99. 98%。对5个不同样品重复检测；每个样品同时进行5次重复，结果重复性很好；同时扩 增，结果存在显著差异的为8% ；不同时间扩增，结果存在显著差异的为6. 7% (图1Β)。(3)反应结束后，将模板DNA的循环阈值C(t)与标准曲线对照，得到模板DNA中的 EB基因片段拷贝的浓度。实施例2 本发明的EBV-DNA荧光定量PCR试剂盒检测检测鼻咽癌病人血浆 EBV-DNA 浓度图2为本发明的EBV-DNA荧光定量PCR试剂盒检测检测鼻咽癌病人血浆EBV-DNA 浓度的一个优选的结果图，方法同实施例1中所述的方法。其中，图2A显示样品扩增曲 线清晰，阴性对照无任何扩增；图2B为对照用的标准曲线。PCR扩增结果用自动分析软 件SDS (Version 2. 0)进行自动分析。血浆EBV-DNA定量结果按公式换算C = QX (Vdna/ Vpce) X (1/Vext)。其中C为待测血浆中EBV-DNA的浓度(拷贝/ml)，Q为PCR反应得到的 EBV-DNA浓度，Vdna为血浆抽提得到的DNA最终稀释量，Vpce为加入反应体系的点样量，Vext 为抽提DNA所用血浆体积。本发明的FQ-PCR法不仅是快速、高效的，而且其结果的判读非常明确、直观，结果 可靠、特异的。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。序列表<110><120> 一种锁核苷酸(LNA)增敏的EB病毒荧光定量PCR试剂盒及其检测方法和应用
<160>3<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1aattttttct gctaagccca aca23<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2acgggtgggt gtgtgtagtg t21<210>1<211>15<212>DNA<213>LNA_TanMan 荧光探针<400>3ccaccacacc caggc1权利要求
一种锁核苷酸(LNA)增敏的EB病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括LNA(锁核苷酸) TaqMan荧光定量反应液和阳性对照样品，其中，LNA TaqMan荧光定量反应液包括正向引物5’ AAT TTT TTC TGC TAA GCC CAA CA 3’；反向引物5’ ACG GGT GGG TGT GTG TAG TGT 3’；LNA TanMan荧光探针5’ FAM CCA CCA CAC CCA GGC MGB 3’。
2.根据权利要求1所述的锁核苷酸(LNA)增敏的EB病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征 在于，所述阳性对照样品为包含所述EB病毒基因组片段的质粒DNA。
3.一种锁核苷酸(LNA)增敏的EB病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下 步骤(1)荧光定量核酸扩增反应体系的配制在反应管中加入正向引物、反向引物和 LNA-TanMan荧光探针、模板DNA、2 X Taqman通用PCR反应混合液，增加ddH20至反应体系为 15 μ 1，混合均勻；(2)荧光定量核酸扩增将所述步骤(1)得到的混合溶液置于荧光定量检测仪上进行 反应；(3)反应结束后，将模板DNA的循环阈值C(t)与标准曲线对照，得到模板DNA中的EB 基因片段拷贝的浓度。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的正向引物、反向引物和 LNA-TanMan荧光探针的序列如下正向引物5，-AAT TTT TTC TGC TAA GCC CAA CA-3，；反向引物5’ -ACG GGT GGG TGT GTG TAG TGT-3'；LNA-TanMan 荧光探针5’ -FAM-CCA CCA CAC CCA GGC-MGB3，。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的正向引物、反向引物和 LNA-TanMan荧光探针的终浓度均为20 μ M。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)的反应条件为95°C 热启动8分钟预变性后；进入扩增循环95°C 30秒，550C 45秒循环40次。
7.权利要求1所述的锁核苷酸(LNA)增敏的EB病毒荧光定量PCR试剂盒在EB病毒检 测、鼻咽癌诊断治疗、预后判断、监测鼻咽癌治疗后复发和转移方面的应用。
全文摘要
本发明提供了一种锁核苷酸(LNA)增敏的EB病毒荧光定量PCR试剂盒，包括LNA(锁核苷酸)-TaqMan反应液和阳性对照样品，正向引物5’-AATTTTTTCTGCTAAGCCCAACA-3’；反向引物5’-ACGGGTGGGTGTGTGTAGTGT-3’；LNA-TanMan荧光探针5’-FAM-CCACCACACCCAGGC-MGB3’。本发明还提供了一种锁核苷酸(LNA)增敏的EB病毒荧光定量PCR检测方法以及该试剂盒在EB病毒检测、鼻咽癌诊断治疗、预后判断、监测鼻咽癌治疗后复发和转移方面的应用。本发明的试剂盒快速、灵敏度高、操作过程简单、检测的样本量大、安全。
文档编号C12Q1/70GK101899528SQ20091003980
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者石大陆 申请人:广州达健生物科技有限公司