分选蛋白33在肿瘤治疗中的应用的制作方法

专利名称：：分选蛋白33在肿瘤治疗中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分选蛋白33(SortingNexin33)的表达载体的构建以及肿瘤治疗中的用途，所述分选蛋白33是分选蛋白家族的一员，目前对于分选蛋白33在细胞内尤其是在肿瘤细胞中的功能研究的非常少。
背景技术：
：真核细胞与原核细胞的主要区别之一在于其存在多种膜型细胞器，例如具有明显形态特征的细胞核、高尔基复合体、内质网、溶酶体、线粒体及植物中的叶绿体。除此之外，细胞质中还存在着另一类没有明显特征的细胞器，它们调节着细胞内外之间重要物质的转运和交流。内涵体就是一类小泡集合体，它由细胞质膜内吞进来各种各样的物质所组成，这些内吞的物质包括细胞表面受体蛋白及其结合的配体蛋白、营养蛋白(例如低密度脂蛋白LDL受体、转铁蛋白受体等)、其他死亡细胞及侵入的微生物等(GruenbergJ，MaxfieldFR.CurrOpinCellBiol.1995,7:552-563;LemmonSK,TraubLM.CurrOpinCellBiol.2000,12:457-466)。内涵体组成了细胞内的分选系统，决定着内吞物的命运(GruenbergJ,MaxfieldFR.CurrOpinCellBiol.1995,7:552-563;LemmonSK,TraubLM.CurrOpinCellBiol.2000,12:457-466)。同时研究表明，内涵体还参与了从高尔基体合成的蛋白的运输与回收(DahmsNM,LobelP，KomfeldS.JBiolChem.1989,264:12115-12118;KatzmannDJ,OdorizziQEmrSD.NatRevMolCellBiol.2002,3:893-905)。哺乳动物细胞的蛋白在分泌及内吞中的转运过程中，涉及到通过高度协调的膜泡系统的分选和传送。这些膜泡系统中包括了一类富含特定磷脂(Phospholipids)的内膜系统，这些磷脂有固有存在的，也有经过细胞外信号刺激而产生的。在真核生物中，蛋白和脂类物质的结合是解释其他蛋白质的激活和膜吸收的一个重要机制。这个过程由一些可以于磷脂特异性结合的结构域介导，这些结构域包括PH(PleckstrinHomology)、FYVE(Fablp、YOTB、Vaclp和EEA1)、ENTH(epsin氨基端同源域)、ANTH、FERM、PHD、Tubby、C2和PX结构域。在这些结构域中，FYVE和PX结构域更多地选择性地与Ptdlns4P结合，并且含有FYVE和PX结构域的蛋白质主要定位在内涵体膜上。其中，分选蛋白(SortingNexin)家族就是一类含有保守PX结构域的蛋白(SeetLF，HongW.BiochimBiophysActa.2006,1761:878-896)。根据结构特点，分选蛋白家族可以分为三类。第一类SNXPX，即只具有PX结构域。SNXPX这个大类包括6个SNX，即SNX3、SNX10、SNX12、SNX22、SNX23及SNX24。第二类SNXPX-BAR。SNXPX-BAR这个大类包括SNX家族中已知的SNX1、SNX2、SNX4、SNX5、SNX6-9、SNX18，与新的家族基因SNX30、SNX32、SNX33(分选蛋白33)(SeetLF,HongW.BiochimBiophysActa.2006,1761:878-896)。BAR(Bin/amphiphysin/Rvs)结构域具有形成而二聚体的能力，还可以诱导膜的弯曲化。因此，SNXPX-BAR这一类SNX蛋白可能因为其参与调节膜转运而成为一类特殊的SNX。第三类SNXPX《'hCT。这类包括17个SNX基因，既已知的SNXll、SNX13-17、SNX19-21、SNX25-29及新家族基因SNX31(SeetLF,HongW.BiochimBiophysActa.2006，1761:878-896)。分选蛋白主要在蛋白质的分选和转运过程中发挥着重要的功能(WorbyCA,DixonJE.NatRevMolCellBiol.2002,3:919-931)。分选蛋白33和SNX9、18在SNX家族中属于一个亚类，在结构上都具有保守的PX结构域、SH3结构域和BAR结构域。目前对分选蛋白33的研究比较少。2008年，研究者鉴定出了这个新的分选蛋白，作为APP(amyloidprecursorprotein)a分泌酶分裂的一个新的激活因子(SchobelS,NeumannS，HertweckM，etal.JBiolChem.2008,283:14257-14268)。在培养体系中外源表达分选蛋白33可以增加APPa分泌酶分裂的能力，但是对p分泌酶分裂的能力没有影响，这一表型和Dynaminl抑制型突变体K44A的结果类似(SchobelS,Neumanns,HertweckM等，JBiolChem.2008,283:14257-14268)。分选蛋白33结合到内吞的GTPasedynamin并降低dynamin依赖性的APP的内吞速度(SchobelS，NeumannS，HertvveckM等，JBiolChem.2008,283:14257-14268)。另外一个研究表明，在神经细胞系及非神经细胞系过表达分选蛋白33会增加全长PrP(Sc)从质膜的脱落及缓和PrP(Sc)的内吞过程(HeisekeA，SchobelS，LichtenthalerSF等，Traffic.2008,9:1116-1129)。在此，我们证明了在肿瘤细胞系中过表达或者抑制分选蛋白33都会使得肿瘤细胞生L<:停滞而最终死亡，说明分选蛋白33对于肿瘤细胞生长起着非常重要的作用，并且这些结果可以为以分选蛋白33作为靶点设计、开发抗肿瘤药物奠定理论基础，提供了肿瘤治疗的新手段或新药物的应用方式。
发明内容在本发明中，发明人将人的分选蛋白33(SNX33)基因(序列见SEQIDNO:1)的CDS构建到带有Myc和GFP标签的真核表达载体中，以便验证分选蛋白33(序列见SEQIDNO:2)在肿瘤细胞中的功能。令人惊讶的，发明人发现，当人分选蛋白33在肿瘤细胞系Hela或者MCF7过表达时，与空载体形成的稳定转染表达株相比，肿瘤细胞系Hela或者MCF7因形成类微核的结构而不能正常生长；同时，若在肿瘤细胞系Hela或者MCF7利用特异的shRNA载体抑制内源性的分选蛋白33，也会使得肿瘤细胞系Hela或者MCF7停滞在Gl期而不能正常生长，并且伴随大量细胞的调亡。因此，使用我们所构建的分选蛋白33的过表达载体或者利用特异的shRNA载体，可以作为新的研究手段和材料应用于肿瘤治疗。图1:显示了SNX33的蛋A表达水平分析。通过Western-Blotting分析，我们发现在A549、Pro5、PC3、SPCA1、NCIH460、HT1080、Hlamp、HEK293T、HT1080、GLC82、L-78、MCF7和Hela这13株细胞系中，除了Hamp细胞系表达较少外，SNX33在大部分的细胞中均高量表达。其中GAPDH是内参，显示我们所用的蛋白量基本一致，SNX33蛋白过夜封闭SNX33抗体后，再检测所分析细胞系发现，SNX33的特异条带消失，说明SNX33抗体所检测到的目的条带是SNX33蛋白。图2:显示了SNX33在Hela细胞中不能形成稳定转染表达株。将融合有GFP的SNX33和对照载体转染到Hela细胞中，24小时后分至100mm大盘中筛选。筛选6天后发现，对照细胞可以形成形态正常的克隆，而SNX33却因为不能形成克隆而逐渐死亡。A:形态观察分析；B:细胞生长曲线分析。图3:A显示了过量表达SNX33在Hela细胞中形成微核现象。将融合有GFP的SNX33同对照载体分别转染到Hela细胞中，24小时后显微镜下观察发现，与对照相比，GFP-SNX33转染的Hela细胞60%左右的细胞核异常，形成类似于微核的现象，而这种现象并没有伴随DNA含量的增加；B显示了激光共聚焦显微镜下观察发现，与对照相比，GFP-SNX33转染的Hela细胞60n/。左右的细胞核异常，形成类似于微核的现象图4:显示了抑制内源性SNX33的细胞形态分析。我们在Hda和MCF7细胞中转染分别转染了对照载体及抑制载体shRNA,用潮霉素进行筛选，7天后观察发现，内源性SNX33被抑制后，细胞形态发生了很大的改变，变成类神经样细胞，即狭长而多触角。统计结果显示，在内源性SNX33被抑制后，这种类似神经样的细胞占总细胞数的60-80%;对照细胞中，这种类神经样的细胞仅占总细胞数的5-10%。图5:显示了抑制内源性SNX33的WesternBlotting分析。我们在Hela和MCF7细胞中转染分别转染了对照载体及抑制载体shRNA，转染24小时后，用潮霉素进行筛选，7天后WesternBlotting分析。其中，检测一抗为我们自制的多克隆抗体SNX33抗体，并以GAPDH作为内参。WesternBlotting结果显示，shRNAl都可以很好的抑制Hela和MCF7细胞中内源的SNX33的表达。图6:显示了抑制内源性SNX33的细胞周期分析。我们在Hela和MCF7细胞中转染分别转染了对照载体及抑制载体shRNA，用潮霉素进行筛选，7天后进行细胞周期分析。细胞周期结果显示，与对照相比，内源性SNX33被抑制后，细胞的G1期明显增加(Hela细胞，从51.28%增加到59.05%;MCF7细胞，从48.68%增加到63.66%)，S期相对的降低(Hela细胞，从40.15%增加到34.84%;MCF7细胞，从37.77%增加到29.73%)。本实验说明，内源性SNX33被抑制后，细胞的生长停滞了图7:显示了抑制内源性SNX33的细胞凋亡分析。我们在Hela和MCF7细胞中转染分别转染了对照载体及抑制载体shRNA，用潮霉素进行筛选，7天后进行细胞凋亡那分析。凋亡结果显示，内源性SNX33降低后，细胞的凋亡水平显著增加(Hela细胞，从27.16%增加到42.33%;MCF7细胞，从37.38%增加到63.98%)。其中，对照载体的凋亡率相对较高的原因，可能是因为细胞处于潮霉素筛选所致。具体实施方式-如上文所述，本文中使用的分选蛋白33是分选蛋白家族的一员，具有传统分选蛋白所具有功能，即在蛋白的分选和运输中发挥着功能(SchobelS,NeumannS，HertweckM等，JBiolChem.2008,283:14257-14268;HeisekeA，SchobelS，LichtenthalerSF等，Traffic.2008,9:1116-1129))。本文中使用的SNX33基因可以来自包含其的任何动物，优选来自哺乳动物，最优选来自人。本文中使用的肿瘤细胞系可以是现有技术中已经分离建立的任何肿瘤细胞系，优选来自哺乳动物，优选来自人，最优选是Hela或者MCF7。本发明还涉及使用SNX33基因抑制肿瘤细胞系增殖的方法，所述方法包括(a)调整肿瘤细胞系中内源SNX33的表达水平；(b)在适合于肿瘤细胞系生长的条件下培养步骤(a)中得到的肿瘤细胞；(c)检测肿瘤细胞系的生长状况；其中所述检测肿瘤细胞系的状况包括观察(b)中肿瘤细胞形态、检测(b)中的肿瘤细胞系的生长情况、检测(b)得到的肿瘤细胞系的细胞周期情况；或者检测(b)得到的肿瘤细胞系的调亡情况。本文所述的调整肿瘤细胞系中内源SNX33的表达水平可以通过在肿瘤细胞系中过量表达SNX33基因或者抑制内源性SNX33基因的表达来实现。在本文中使用时，可以通过将外源SNX33编码基因引入肿瘤细胞系中来在肿瘤细胞系中过量表达SNX33基因。或者，可以通过将抑制SNX33基因的内源表达的核苷酸序列引入肿瘤细胞系来抑制内源性SNX33基因。抑制SNX33基因内源表达的核苷酸序列可以是siRNA或者shRNA。可以通过本领域己知的任何手段将SNX33的编码基因或者抑制内源性SNX33的shRNA引入肿瘤细胞系，例如脂质体转染、基因枪、病毒(例如腺病毒)介导的转染、电穿孔等。优选地使用脂质体转染技术。本文中使用的shRNA是指能够抑制内源性分选蛋白33的短发卡状RNA，它可以由本领域的技术人员根据分选蛋白33的核苷酸序列容易地设计。本文所使用的一个实例是由德国弗莱堡大学的StefanF.Lichtenthaler博士赠送的shRNA(序列见SEQIDNO:3)。在本文中所提及的观察肿瘤细胞形态可以应用显微镜镜下观察，例如应用奥林巴斯显微镜镜下观察。在本文中提及的检测肿瘤的生长情况是指在培养基中培养传代过程中在显微镜镜下观察细胞形态的过程。例如，在本文的实施例中，在1640(GIBCO)中添加10°/。FBS(Hyclone)的培养基中培养及传代的过程，并在奥林巴斯显微镜下观察细胞的形态等。'在本文中提及的检测肿瘤细胞系的细胞周期情况是指检测细胞周期的任何方法所能检测的细胞周期。例如，使用流式细胞仪对细胞周期的检测。在本文下文所述的一个实施例中，在1640(GIBCO)中添加10%FBS(Hyclone)的培养基中培养肿瘤细胞系，在达到分析要求时利用细胞周期试剂盒(CycletestPlusDNAReagentKit,BD公司)进行消化和PI染色，然后利用流式细胞分析仪(FACScalibur，BD公司)进行细胞周期分析。在本文中提及的检测肿瘤细胞系的凋亡情况是指能够检测细胞凋亡率的任何方法。例如，通过凋亡试剂盒，利用流式细胞仪检测的细胞凋亡情况。在本文中的一个实施例中，在1640(GIBCO)中添加10%FBS(Hyclone)的培养基中培养肿瘤细胞系，并将目的质粒转染入肿瘤细胞系，筛选培养后，用调亡试剂盒(PEAnnexinVApoptosisDetectionKitI，BD公司)进行染色，然后在1小时内利用流式细胞仪(FACScalibur,BD公司)进行细胞凋亡情况分析。特别地，将SNX33编码基因或者特异性抑制SNX33的shRNA引入肿瘤细胞系的方法可以是转染方法，包括构建在肿瘤细胞系中表达的包含SNX33基因的载体或者特异性抑制载体shRNA;以及将所构建的载体转染进入肿瘤细胞系中。所述转染可以通过本领域己知的任何方法来进行，例如应用脂质体转染、磷酸钙转染等。可以通过本领域已知的任何方法构建能在肿瘤细胞系中表达的包含SNX33基因的载体，优选使用本领域熟知的真核细胞表达载体pCR3.1(来自hwi加gen公司)。本文所使用的肿瘤细胞系的生长条件是本领域技术人员熟知的，例如司徒镇强编著的《细胞培养》中所述的那些培养方法以及培养条件。本文所使用的检测基因的方法包括本领域已知的任何方法，如PCR、WesternBlotting、免疫荧光、细胞周期分析等，这些方法在Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等人编著(1987))等多种参考文献中均有详细的描述。本发明还涉及利用本发明所述的SNX33基因或者其shRNA抑制肿瘤增殖的方法。本发明还涉及SNX33基因抑制肿瘤细胞系增殖的用途。具体地，对肿瘤细胞系增殖的抑制在上调肿瘤细胞系中SNX33表达水平时表现为可以使得肿瘤细胞系形成类微核现象而死亡；对肿瘤细胞系增殖的抑制在抑制肿瘤细胞系中SNX33表达水平时表现为引起肿瘤细胞系的形态变化、细胞周期停滞及凋亡率增加。在本文中使用时，类微核现象是指细胞的一种异常结构。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体异常产生的。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。本文中观察到的细胞核异常，和微核现象极为类似，故称为类微核现象，其能够诱导细胞死亡。在本文中使用时，形态变化是指肿瘤细胞的形态由正常情况下的规则的细胞形状和大小，变为不规则的、多个触角的类神经样细胞。在本文中使用时，细胞周期停滞是指转染shRNA后的肿瘤细胞系的Gl期的明显增加想象。在本文中使用时，凋亡率增加是指转染shRNA后的肿瘤细胞系的调亡率增加。实施例下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例。根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。实施例l:细胞系的培养人细胞系(A549、Pro5、PC3、SPCA1、NCIH460、HT1080、Hlamp、HEK293T、HT1080、GLC82、L-78、MCF7禾卩Hela)培养在添加了10%胎牛血清FBS(Hyclone)的培养基在37'C培养箱中培养(参见QinB,HeM,ChenX等人，JBiolChem.2006,281:36891-36896)。实施例2:不同细胞系中SNX33蛋白(SEQIDNO:2)的表达情况首先将人不同细胞系(A549、Pro5、PC3、SPCA1、NCIH460、HT1080，Hlamp、HEK293T、HT1080、GLC82、L-78、MCF7和Hela)通过RIPA裂解液裂解得到蛋白裂解液。如图1所示，通过Western-Blotting分析，我们发现在A549、Pro5、PC3、SPCA1、NCIH460、HT1080、Hlamp、HEK293T、HT1080、GLC82、L-78、MCF7和Hela这13株细胞系中，除了Hlamp细胞系表达较少外，SNX33在大部分的细胞中均高量表达。其中GAPDH是内参，显示我们所用的蛋白量基本一致，SNX33蛋白过夜封闭SNX33抗体后，再检测所分析细胞系发现，SNX33的特异条带消失，说明SNX33抗体所检测到的目的条带是SNX33蛋白。本实施例说明，分选蛋白33是不同细胞系中都普遍表达，在肿瘤细胞系(例如Hela和MCF7)中普遍表达。实施例3:SNX33载体(SEQIDNO:l)的构建用终体积为20ul的反应体系逆转录2ug的总RNA(参见Pan,G等人，(2006)FasebJ20(10)，1730-1732)，得到cDNA文库。利用表1的引物扩增人SNX33片段，然后用琼脂糖凝胶电泳回收。表l:克隆SNX33片段的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>用于真核表达的质粒通过在融合有绿色荧光蛋白GFP的pCR3.1载体的多克隆位点EcoRV插入PCR片段构建的，即在37'C下通过EcoRV酶切pCR3.1载体4小时，然后将从人胚肾细胞HEK293T的cDNA中扩增的人SNX33片段，在连接酶的存在下16'C连接4小时，得到真核表达载体GFP-SNX33。实施例4:构建稳定转染的肿瘤细胞系、形态观察及生长曲线分析我们将融合有绿色荧光蛋白GFP的SNX33真核表达质粒(GFP-SNX33)与对照质粒GFP各2ug，瞬时转染入Hela细胞中，之后将细胞消化并重新种入100mm的培养皿中观察GFP阳性细胞的形态。图2A显示在转染6天后，对照GFP阳性的细胞可以形成均一的克隆，细胞形态和状态良好；而转染了SNX33的Hela细胞却不能分裂，仍为一个单一的细胞直至死亡。同时我们检测了稳定转染后的Hela细胞生长曲线(图2B)，和从形态上观察到结果一致，对照转染Hela细胞的生长曲线正常，细胞数在不停的增长；而SNX33转染后的细胞基本处于生长停滞状态，细胞数随着阳性细胞的死t不停的减少。此结果也在MCF7胞中得到了验证(结果未显示)。实施例5:过表达SNX33引起肿瘤细胞系的微核现象为了了解SNX33是如何来影响细胞分裂从而影响到细胞状态的，我们仔细观察了瞬转后的Hela细胞。从图3A屮我们可以明显的发现在转染24小时后，对照空载体GFP的Hela细胞中，表达荧光的细胞基本上正常；而转染了融合GFP的SNX33后，带有GFP阳性的被转染细胞中有很大一部分细胞产生了类似于微核的现象，即产生了大小不一的两个或者多个的类似于微核的结构(占转染后阳性细胞的60%左右，而对照细胞基本上没有类似现象)。图3B的激光共聚焦结果可以清晰的看到多达5个大小不一的类似于微核的结构，并且次结构DAPI染色呈阳性，说明为染色质结构。为了消除GFP融合后对SNX33功能的影响，我们还应用了Myc标记的SNX33进行免疫荧光检湖ij，结果同融合GFP标记的结果一致，即均产生多个类似微核的结构。为了搞清楚这种现象是否意味着细胞核的分裂而细胞不分裂，我们将瞬时转染的细胞进行了流式分析。从流式分析的结果(图3A)中可以看出，转染了SNX33的细胞核同转染了对照载体的细胞一样，其细胞核的DNA含量并没有改变，即说明了SNX33过表达的细胞其染色体的含量并没有改变，只是细胞核的分裂受到了影响，产生了类似于微核的现象。此结果也在MCF7肿瘤细胞系中得到了同样的验证(结果未显示)。实施例6:特异地抑制内源SNX33的表达会引起细胞形态的改变为了研究SNX33的功能，我们从StefanF丄ichtenthaler博士(LudwigMaximiliansUniversity,Schillerstr.44,80336Munich,Germany)那里获得了SNX33的特异性抑制载体(shRNA)及对照载体(chobelS，NeumannS，HertweckM等，JBiolChem.2008,283:14257-14268)。我们尝试在肿瘤细胞系Hela和MCF7中建立特异地抑制了SNX33的稳定转染表达株。我们将对照载体及特异性抑制载体shRNA分别转染到Hela和MCF7细胞中，转染24小时后，用潮霉素进行筛选。l周后我们发现，与对照相比，内源性SNX33被特异地抑制后，Hela和MCF7细胞的形态发生了显著的改变，细胞变得狭长及具有很多的触角，类似于神经细胞(图4)。通过统计分析发现，在内源性SNX33被抑制后，这种类似神经样的细胞占总细胞数的60-80%;而对照细胞中，这种类似神经样的细胞仅占总细胞数的5-10%。同时WesternBlotting检测显示，内源性的SNX33被抑制的很充分(图5)。实施例7:特异地抑制内源SNX33的表达会引起细胞周期的改变和细胞凋亡的增加接下来，我们将所获得类神经样细胞分别进行细胞周期(图6)和凋亡分析(图7)。细胞周期分析(图6)显示，与对照相比，内源性SNX33被抑制后，细胞的Gl期明显增加(Hela细胞，从51.28%增加到59.05%;MCF7细胞，从48.68°/。增加到63.66%)，S期相对的降低(Hela细胞，从40.15%增加到34.84%;MCF7细胞，从37.77%增加到29.73%)。这和我们所观察到的现象一致，即细胞的生长几乎停滞了。细胞凋亡的分析(图7)显示，内源性SNX33降低后，细胞的凋亡水平显著增加(Hela细胞，从27.16%增加到42.33%;MCF7细胞，从37.38%增加到63.98%)。因此，我们得出结论，内源性SNX33被抑制后，会引起细胞周期Gl期的显著增加、S期的相对降低及细胞凋亡率的显著增加。通过以上实验可以看出，过表达分选蛋白33(SNX33)或者特异性地抑制分选蛋白33都会引起肿瘤细胞系的不正常生长现象，因此可以作为一种全新的药物作用靶点和研究工具来研究其他可行的肿瘤治疗手段及方法。序列表〈110〉中科院广州生物医药与健康研究院〈120〉分选蛋白33在肿瘤治疗中的应用〈130〉参考<160〉33〈170〉Patentln版本3.3<210〉1<211〉1725〈212〉腿〈213>人(Homosapiens)<220〉〈221〉SNX33基因ggaaatcagc60ctggctgcag120gatcgtccgt180tcccggagcc240tgggggcagt300ggatgactgg360caacgggcac420cttccggccc480tgtggtgggc540catcctgggt600ccctcgtggc660cacaaaacag720〈400〉13tggCaCtg3朋ggCCg3gCCCtct3tg3CtttC3C3gtg3g33C33gg3atccagcaggatgaggacctggtcatctttagcgagacctcactggatggggccagaacagccgtggggagacagggctctttcctgcctcttatgtggatctggcatcagcaccaaccatgctgactactccagcagccctgcaggctccaggtgagcttgtac犯cagccccagtgtggccagcccagctaggagtggggcttcctctcaaaccagggtagctttgaggaggatgatgatgatgactggacgacggatgcacagtggtggaggagccacgggctggtgggctgggcaccctcccctcaacctctcctaccctggtgcctaccccagccagcacatggcaagccaccactggagcggcaggacagcctggcatctgccaagcgaggcagcgtaacctcaaccgtttctcatgctttgtgcgttctggagtggaggccttgatgtgcccatgatggcc犯gatcgctgagacatactccattg肌atgggccccagtggaaggccaatccccacccatttgcctgctctgtggaggacccaccaaattcaagggcatcaaaagctacatctcctacaagctcacacccacccatgctgcc780tcacccgtctaccggcgctacaaacactttgactggctctataaccgcctgctacacaag840ttcactgtcatctcggtgccccacctgcctgagaagcaggccactggccgcttcgaggag900gacttcatcgaaaagcggaagcggagactcatcctctggatggaccacatgaccagccac960cctgtgctctcccagtacgaaggcttccagcatttcctcagctgcctggatgacaagcag1020tggaagatgggcaaacgccgggcggag卿gatgagatggtgggtgccagcttcctgctc1080accttccagatccccaccgagcaccaggacttgcaggacgtggaagatcgcgtggacact1140ttcaaggccttcagtaagaagatggacgacagcgtcctgcagctcagcactgtggcatca1200gagctggtgcgtaaacatgtggggggcttccgcaaggaattccag犯gctgggcagtgcc1260ttccaggccatcagtcattccttccagatggacccccccttttgctctgaggccctcaac1320agtgccatttctcacacgggccgtacctatgeiagccatcggggagatgtttgctgagcag1380cccaagaatgacctcttccagatgctggacacactgtctctctaccagggcctgctctcc1440aacttccctgacatcatccatctacaaaaaggcgccttcgccaaggtgaaggagagccaa1500cgcatgagtgacgagggccgcatggtgcaggacgaggcagacggcattcgcaggcgctgc1560cgcgtggtgggtttcgccctgcaggccgagatgaaccacttccaccagcgccgtgagctc1620gacttcaagcacatgatgcagaactacttgcgccagcagatcctcttctaccagcgggtg1680ggccagcagctggagaagaccctgcgcatgtatgacaacctctga1725〈210〉2〈211〉575〈212〉PRT〈213〉人(Homosapiens)〈220〉〈221〉SNX33蛋白质〈400〉2MetAlaLeuLysGlyArgAlaLeuTyrAspPheHisSerGluAsnLysGluGlulieSer15101520lieGinGinAspGluAspLeuValliePheSerGluThrSerLeuAspGlyTrpLeuGin25303540GlyGinAsnSerArgGlyGluThrGlyLeuPheProAlaSerTyrValGlulieValArg45505560SerGlylieSerThrAsnHisAlaAspTyrSerSerSerProAlaGlySerProGlyAal65707580GinValSerLeuTyrAsnSerProSerValAlaSerProAlaArgSerGlyGlyGlySer859095100GlyPheLeuSerAsnGinGlySerPheGluGluAspAspAspAspAspTrpAspAspTrp105110115120AspAspGlyCysThrValValGluGluProArgAlaGlyGlyLeuGlyThrAsnGlyHis125130135140ProProLeuAsnLeuSerTyrProGlyAlaTyrProSerGinHisMetAlaPheArgPro145150155160LysProProLeuGluArgGinAspSerLeuAlaSerAlaLysArgGlySerValValGly1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