专利名称：具有杀狄斯瓦螨活性的组合几丁质酶及其应用的制作方法
技术领域：
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本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有杀狄斯瓦螨活性的组合几丁质酶，及其在 杀狄斯瓦螨中的应用，该组合几丁质酶包括几丁质酶ChiA和几丁质酶ChiB。
技术背景-
蜜蜂寄生螨一直是世界养蜂业最主要的危害之一，在全球范围危害，目前除澳大利亚、 非洲部分地区尚未发现蜂螨外，其它洲的蜂群都受到蜂螨的危害。蜜蜂的外寄生螨狄斯瓦螨 (俗称大蜂螨)(Fam "fifeWrac/or Anderson &Trueman)吸食蜜蜂成蜂或幼虫的体液，造成蜜
蜂体质下降，蜂群群势衰弱；此外，蜂螨还传播蜜蜂细菌和病毒病害。据报道，最近在美国
等国出现的蜜蜂蜂群崩溃失调病(CCD)也与蜂螨的危害有关。每年我国养蜂业仅蜂螨造成 的直接损失就达到几个亿人民币，而且因防治蜂螨使用药物造成蜂产品污染的间接损失更是 不可估量。
目前主要用于防治蜜蜂螨害的方法有以下3种(l)物理机械法如蜂群的热处理；(2) 化学防治法如使用杀螨剂如有机酸和香精等；(3)生物技术防治法包括蜜蜂饲养管理技 术。但是目前使用最广泛的主要还是用药物来防治大蜂螨，其中使用最为普遍的是一种以拟
除虫菊酯类农药-氟胺氰菊酯为主要原料的杀螨剂"螨扑"(Apistan)。不可否认，药物治螨起 了一定的积极作用。但是，连续和大范围使用导致的污染和抗药性问题越来越严重。显然单 靠药物治螨是不够的，还必须寻找其它途径来防治蜂螨。
一些生物防治技术已应用于防治蜂螨，如(1)割除雄蜂房法自从西方蜜蜂身体上发现
蜂螨，也发现蜜蜂对于蜂螨有清除行为，并可减轻蜂螨对蜂群所造成的危害。与此同时，养 蜂工作者在实践中发现，割除雄蜂房也能降低蜂群中蜂螨的寄生密度，减弱蜂螨对蜂群所造
成的危害。(2)使用抗螨除虫多功能巢础利用蜂螨繁殖于封盖房，寄生于蜂体上这一生物 学特性，直接把杀螨药物藏于蜂房中，阻断蜂螨幼虫在雄蜂房中正常羽化成成螨，从而达到 杀灭蜂螨这一目的。(3)人工选育抗螨新品种中华蜜蜂对于大蜂螨具有一定的抗性，蜂群 内虽曾发现蜂螨，但未给蜂群造成危害。而且西方蜜蜂对于蜂螨也有一定的清理行为，养蜂 工作者可以在蜂群中选择对蜂螨有较强清理行为的蜜蜂为种群，定向培育抗螨性强的蜂群，
包括蜜蜂营养杂交(又称为蜜蜂无性杂交)。(4)利用病原真菌绿僵菌(Meto/^z/, a"&op/Z"e)和/fi"w/e〃fl Z/ww/wo"//对大蜂螨具有一定的防治效果。
但是，这些措施对蜂螨的控制效果并不令人满意，如割除雄蜂房法很难彻底消除螨害；由于长期以来自养自繁的养蜂模式导致的蜜蜂严重混杂退化和近亲繁殖衰退现象，培育抗螨 品系的稳定性也不尽人意；病原真菌的应用仍受制于更有效品系的筛选、蜂巢温湿度、贮存 方法和施用技术。因此，养蜂界仍在严重依赖业已产生抗性和引起残留的化学农药防治蜜蜂 害螨。抗生素和化学农药的滥用，已经对我们的食品安全和国际贸易造成巨大的威胁。因此， 养蜂业急需安全防治蜂螨的替代防治方法，热切期待环境友好的蜜蜂螨害防治新技术。
几丁质酶能够催化水解几丁质，产生几丁寡糖或几丁二糖。在自然界中很多微生物可以 产生几丁质酶。几丁质酶具有广泛的生理功能，在生物防治方面得到了普遍应用；另外，几 丁质酶对杀虫剂有增效作用，可加速害虫的致病过程；几丁质酶还可抑制病原真菌的生长。 但是，到目前为止，未发现利用几丁质酶控制蜜蜂狄斯瓦螨的报道。
发明内容
本发明目的是提供了一种具有杀狄斯瓦螨活性的组合几丁质酶及其应用，该组合几丁质 酶包括几丁质酶ChiA和几丁质酶ChiB。
本发明是通过以下技术方案予以实施的
本发明从粘质沙雷氏菌GEI的基因组DNA中克隆出一段基因碱基序列，该基因的编码 蛋白对狄斯瓦螨具有比较强的毒性，几丁质酶活力为15.9 U/mL的条件下，沾染该蛋白的狄 斯瓦螨，5天后死亡率为40%。经过测序分析表明，该基因的开放读码框含有1692个碱基， 序列如SEQ ID NO.l所示，BLAST分析表明该基因与登录号为AF454462.1的粘质沙雷氏菌 几丁质酶基因c/zM的相似性为96%,由此认为该基因属于几丁质酶基因c/z"类别，是一个 几丁质酶基因c/z"类的新序列，推测其编码的几丁质酶ChiA为61.09KDa。
应用同样的方法本发明人从粘质沙雷氏菌&/ra"a mwce;ycera GEI的基因组DNA中克隆 出一段基因碱基序列，应用原核表达载体pET-32a(+)，在大肠杆菌中表达该基因，对该基因 的编码蛋白进行纯化、复性、生物测定表明，该基因的编码蛋白对狄斯瓦螨具有比较强的毒 性，该蛋白酶活力为14.5 U/mL的条件下，沾染该蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率为40%。 经过测序分析表明，该基因的开放读码框含有1500个碱基，序列如SEQ ID N0.2所示，BLAST 分析表明该基因与登录号为Z36295.1的粘质沙雷氏菌几丁质酶基因c/ '5的相似性为96%， 由此认为该基因属于几丁质酶基因c/z诏类别，是一个几丁质酶基因c/z/5类的新序列，推测 其编码的几丁质酶ChiB为55.53kDa。
本发明还通过实验发现几丁质酶ChiA与ChiB在杀狄斯瓦螨时候，两者具有协同效应， 当几丁质酶ChiA和ChiB组合使用的时候，其表现的对狄斯瓦螨毒性比单独使用任一种几丁 质酶ChiA或者ChiB都高，对狄斯瓦螨具有高致死率。将上述几丁质酶ChiA (15.9U/mL) 与几丁质酶ChiB (14.5U/mL)等体积混合后，该组合酶的酶活力达到34.8 U/mL，沾染该组合酶的狄斯瓦螨，在5天后，蜂螨的死亡率达到了 93.3%。将上述酶活力的几丁质酶ChiA和 几丁质酶ChiB，按照体积比1: 2和2: 1混合后发现，其酶活力分别为29.4U/ml和30.2U/ml， 5天后，沾染组合酶的狄斯瓦螨，蜂螨的死亡率分别为83.3%和85.2%。由此可以证明几丁质 酶ChiA和几丁质酶ChiB两者之间具有协同作用。在组合酶中，两种酶的含量比在其他比例 的情况下，协同作用这种能力是存在的，两者含量比的关系与其协同作用的大小有关(表征 为组合酶的酶活力和对狄斯瓦螨的致死率)，最佳比例的混合才能使得协同作用的表征出对狄 斯瓦螨的致死率达到最高，但是只要两种酶都同时存在，该组合酶是具有协同作用这种能力 的。
本发明组合几丁质酶的使用可以直接应用几丁质酶ChiA和ChiB混合一起作为制剂使 用，也可以将上述两个几丁质酶的编码基因转入同一或者不同的工程菌中、转入蜜蜂中或者 将两个几丁质酶基因融合后，在转入目的生物当中，表达几丁质酶基因，应用于狄斯瓦螨的 防治。
本发明从粘质沙雷氏菌Swrar/a wflrce"em GEI中克隆得到的新的几丁质酶ChiB的编码 基因和几丁质酶ChiA的编码基因，其编码蛋白都对狄斯瓦螨具有较高的毒性，在几丁质酶 ChiB活力为14.5U/ml，沾染该酶的狄斯瓦螨，5天后死亡率为40%，几丁质酶ChiA活力为 15.9U/mL的条件下，沾染该蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率为40%。当将几丁质酶ChiA和 几丁质酶ChiB混合后，该组合液表现的对狄斯瓦螨致死率比单独使用任一种几丁质酶ChiA 或者ChiB都高。本发明的实现为实现对环境友好的蜜蜂螨害防治新技术提供了途径，可广泛 的应用于防治蜜蜂螨害，可以将本发明几丁质酶ChiA和ChiB的编码基因转入同一或者不同 的工程菌中、转入蜜蜂中或者将两个几丁质酶基因融合后，在转入目的生物当中，表达几丁 质酶基因，应用于狄斯瓦螨的防治，从而实现生物安全防治蜜蜂螨害，克服了化学药物的抗 性和残留等等问题。
本发明所述的沙雷氏菌GEI w"rc"cem GEI于2009年5月6日，保藏于中国
典型培养物保藏中心(CCTCC，地址中国武汉市武汉大学)，保藏编号为CCTCCM209097。
图1是从粘质沙雷氏菌株&rrartamflrc"cera GEI基因组中扩增得到c/ "基因，1. c/z" PCR产 物；M.DL2000DNA Marker;
图2是从粘质沙雷氏菌株warc"cew GEI基因组中扩增得到cW万基因，1. c/ '5 PCR产 物；M.DL2000DNA Marker;
图3是SDS-PAGE分析几丁质酶ChiA重组蛋白的诱导表达，1.未诱导的BL21 (DE3) /pET-32a(+)重组菌；2. IPTG诱导的BL21 (DE3)/pET-32a(+)重组菌；3.未诱导的BL21 (DE3)/pET-32a(+)-chiA; 4. IPTG诱导的BL21 (DE3) /pET-32a(+)-chiA重组菌
图4是SDS-PAGE分析几丁质酶ChiB重组蛋白的诱导表达，1.未诱导的BL21 (DE3)
/pET-32a(+)重组菌2. IPTG诱导的BL21 (DE3)/pET-32a(+)重组菌；3.未诱导的BL21 (DE3)
/pET-32a(+)-chiB; 4. IPTG诱导的BL21 (DE3) /pET-32a(+)-chiB重组菌；
图5是SDS-PAGE分析复性后的几丁质酶ChiA重组蛋白，1. IPTG诱导的BL21 (DE3)
/pET-32a(+)-chiA重组菌；2. IPTG诱导的BL21 (DE3) /pET-32a(+)-chiA重组菌的包涵体蛋
白的复性蛋白；
图6是SDS-PAGE分析复性后的几丁质酶Ch旧重组蛋白，1. IPTG诱导的BL21 (DE3) /pET-32a(+)-chiB重组菌；2. IPTG诱导的BL21 (DE3) /pET-32a(+)-chiB重组菌的包涵体蛋 白的复性蛋白；
图7是不同浓度的NGA在A=550nm条件下的吸光度值的标准曲线； 图8是不同浓度的BSA在A=595nm条件下的吸光度值的标准曲线；
图9是几丁质酶ChiA复性蛋白液、几r质酶ChiB复性蛋白液以及几丁质酶ChiA和ChiB复 性蛋白液组合对狄斯瓦螨的毒性测定，A.几丁质酶ChiA; B.几丁质酶ChiB; C.几丁质酶 ChiA和ChiB复性蛋白液组合(体积比l: 1); D.蛋白溶解液；E.透析液；
具体实施例子-
以下对本发明做进一步的解释，但不是对本发明的限制
本发明所述的粘质沙雷氏菌株5Wr加'fl wflrc^cms GEI是本发明人从从化中蜂工蜂中肠 中分离得到，此菌于2009年5月6闩，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC,地址 中国武汉市武汉大学)，保藏编号为CCTCC M 209097。 一、几丁质酶c/ W、 cWfi基因的克隆和测序。
1. 粘质沙雷氏菌株GEI的培养
从LB平板上挑取粘质沙雷氏菌单菌落接种至4mLLB液体培养基中，振荡培养过夜 (28 °C，200r/min);培养物按3%接种量转接至含lOmL培养基的100 mL锥形瓶，培养 至OD620 2。
2. 细菌基因组DNA的提取
常规试剂盒(TIANGEN细菌基因组提取试剂盒，北京TIANGEN公司)提取粘质沙雷 氏菌株GEI基因组DNA。
3. 引物的设计
根据国外已克隆的粘质沙雷氏菌的几丁质酶基因c/ L4 (accession number: Z36294.1)序歹J， c/ '￡ (accession number : Z36295.1)序列，以粘质沙雷氏菌菌株GEI基因组DNA为模板， 以Primer Premier 5.0和DNASTAR软件辅助，分别设计的引物。
引物序列作用扩增片段 长度
引物AFor:5'匿ATGGATCCATGCGCAAATTTAATA-3' Rev: 5'-GCGGCCGCTTATTGAACGCCGGCGC-3，扩增1692bp
引物BFor:5，-ATGAATTCATGTCCACACGTAAAGCCGT-3， Rev: 5' -GAGCTCTTACGCTACGCGGCCCACCT-3'扩增1500bp
注划线标注的分别是限制性酶切位点￡co/ 1,I,五coJ I, Sac I。 4. PCR扩增几丁质酶基因、
以粘质沙雷氏菌基因组为模板，引物A (引物B)，分别进行PCR扩增cAM (cW5)基 因片段，PCR反应体系及循环设定如下
ddH20 18.7 |xL
10 x PCR buffer 2.5 |_iL
dNTP Mix (10 mmol/L) 0.5
Primer-for (20 (xmol/L) 1
Primer-rev (20 ,ol/L) 1 (xL
DNA模板 1 jxL Easy-A high fidelity cloning enzyme 0.3
Total volume 25
充分混匀，按以下程序进行PCR扩增94°C变性5 min进入循环，94'C变性30 s， 55'C退火30s，72'C延伸1 min 30 s， 30个循环后于72°C继续延伸10 min。反应完成后， 以1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，分别回收引物A，弓I物BPCR扩增出的目的片段，引 物A扩增的目的片段的检测结果如图1所示，引物B扩增的目的片段的检测结果如图2所示， 将片段分别命名为cfe4， cWS。
5.回收的基因片段c/7L4， cWS分别与克隆载体的体外连接 胶回收基因片段cW乂、 c/n'S
(1)在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 nL。pMD18-T Vector 1
DNA回收片段 lpL
ddH20 3 jxL
Total volume 25 |tiL
(2) 加入5pL (等量)的Ligation Mix。
(3) 16 'C反应30分钟。
注)①室温(25°C)也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
6. 连接产物转化co//DH5a感受态细胞
(1) 取出1管感受态细胞50 hL,于冰上缓慢旋转融化；
(2) 加入10 ^L上一步骤的连接产物，轻轻旋转，将连接产物与感受态细胞混合均匀，冰 浴30min;
(3) 42°C热休克45 s，不要摇动离心管；
(4) 立即将离心管转移到冰上，放置1 min;
(5) 加入450 平衡到室温的无菌SOC培养基；
(6) 于37°C， 200r/min水平振荡1 h;
(7) 取25-100 不同体积的菌液铺于预热的LB平板(含有常规浓度的Amp、 IPTG、 X-Gal)上，37°C倒置培养过夜。
7. 几丁质酶c/zL4、 cW5基因阳性克隆鉴定和测序
在平板上进行抗性筛选，挑取经PCR初步鉴定的含有与目的片段相同大小的大肠杆菌转 化子，分别命名为pMD18-T-chiA,pMD18-T-ch旧。将上述转化子委托上海英俊生物技术有限 公司测序。得到几丁质酶A"基因和几丁质酶cWS基因的核苷酸序列，几丁质酶dz"基因 的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，由1692bp的碱基组成，推定编码蛋白几丁质酶ChiA为 61.09 kDa， BLAST分析表明该基因与登录号为AF454462.1的粘质沙雷氏菌几丁质酶基因 C/z"的相似性为96%,由此认为该基因属于几丁质酶c/j"基因类别，是一个几丁质酶c/zL4 基因类的新序列。几丁质酶c/n'5基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2，所示1500bp的碱基组成， 推定其编码蛋白几丁质酶ChiB为55.53kDa， BLAST分析表明该基因与登录号为Z36295.1 的粘质沙雷氏菌几丁质酶基因c/n'B的相似性为96%，由此认为该基因属于几丁质酶基 因类别，是一个几丁质酶c/n'3基因类的新序列。二、几丁质酶c/z"、 CWS基因的原核表达和表达蛋白的纯化、复性和酶活性测定 1.几丁质酶基因在五.co/!' BL21(DE3)中的表达
(1) 分别提取重组质粒pMD18-T-chiA,pMD18-T-chiB (TIANGEN质粒小提取试剂盒，北 京TIANGEN公司)。
(2) 重组质粒pMD18-T-chiA，pMD18-T-chiB的酶切，然后胶回收基因片段chiA， chiB。
pMD18-T-chiA建立如下酶切反应体系
ddH20
10 x H Buffer
0.1%BSA
pMD18-T-chiA
Sac I
22 (iL 6 |aL 6 (jL 20 3 & 3
Total volume
pMD18-T-chiB建立如下酶切反应体系:
ddH20
10 x M Buffer pMD18-T-chiB
■Sac I
60
28
6 |jL 20
3
3
Total volume
60
(3)基因片段chiA, chiB分别与pET-32a(+)表达载体的连接。
将胶回收的目的基因片段与载体DNA以适当的比例建立连接反应，以达到最佳连接效 果。T4DNALigase应最后加入，轻轻混匀反应体系，16°C连接过夜。反应体系如下
10 x T4 DNA Ligase Buffer
pET-32a(+)
基因片段c/z"或
T4 DNA Ligase 5 |xL 5 (iL
1 nL
Total volume 25 |jX
(4) 连接产物转化五.co//BL21(DE3)。
(5) 大肠杆菌转化子的阳性克隆鉴定。 对长出的转化子应用引物A或者引物B进行快速PCR筛选，以1%琼脂糖凝胶电泳检
测扩增结果，在合适大小处出现特异性扩增条带的样品即为阳性克隆，分别获得转入基因片段&"的￡. co/!'BL21(DE3)阳性克隆，命名为BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiA，获得转入基因 片段c&5的￡. co/z'BL21(DE3)阳性克隆命名为BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiB。
(6) 分别用IPTG诱导BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiA和BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiB的目的蛋
白的大量表达。
取活化后的重组大肠杆菌培养物(BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiA或者 BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiB)，按3%比例接种至新鲜LB (Car"培养基中，继续培养至OD600 为0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为lmmol/L， 37°C， 200 r/min诱导培养8h。
(7) 表达产物的SDS-PAGE分析。
取0.2 mL上述诱导后发酵液至1.5 mL洁净离心管中，离心得菌体，加入50 pL双蒸水 与50 pL 2xSDS-PAGE上样缓冲液等体积混合，沸水浴10 min，进行SDS-PAGE电泳检测几 丁质基因c/z^和AW在大肠杆菌中的表达，检测结果如图3和图4所示，经过IPTG的诱导 BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiA表达了几丁质酶ChiA， BL21(DE3)/pET-32a(+)-chiB表达了几丁 质酶ChiB。
对照为转入空载体pET-32a ( + )的BL21 (DE3)菌(未用IPTG诱导和用IPTG 诱导)，以及未用IPTG诱导的克隆子pET-32a(+)-chiA禾Q pET-32a(+)-chiB，由于载体 pET-32a(+)其自带编码一个20.4 kDa的蛋白标签，因此经过IPTG的诱导的克隆子 pET-32a(+)-chiA的表达蛋白大概为81.5kDa， pET-32a(+)-chiB的表达蛋白大概为75.93 kDa， 如图3、图4所示，克隆子pET-32a(+)-chiA和pET-32a(+)-chiB经IPTG诱导后成功表达了几 丁质酶ChiA和ChiB，而其他三个对照没有表达几丁质酶ChiA和ChiB。 2.重组表达几丁质酶ChiA, ChiB的纯化和复性
因为表达的重组蛋白在大肠杆菌中是以不溶性的包涵体形式存在，而包涵体往往是没有 生物活性的，所以需要对表达的重组蛋白进行复性。Invitrogen公司的蛋白复性试剂盒(Protein RefordingKit)能够在弱酸性条件下溶解大肠杆菌中的包涵体重组蛋白，并在中性的环境中对 溶解的蛋白透析两次第一次利用加入还原剂的透析液促使蛋白二硫键的正确形成，第二次 除去多余的还原剂。蛋白复性试剂盒已经成功的应用于细菌的碱性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、 绿色荧光蛋白和葡糖苷酸酶的重组蛋白。具体过程如下
1)制备包涵体
① 取上述含目的蛋白(几丁质酶ChiA或者几丁质酶ChiB)菌液，4'C， 6500rpm离心 15min，弃上清；
② 将沉淀完全重悬于0.1倍菌液体积的lxIB洗涤液，反复混匀；
③ 在细胞裂解的过程中将重悬的溶液置于冰上以防止蛋白受热裂解，可选择超声波裂解或French Press法裂解细胞。其中超声波裂解细胞是更广泛应用的一种方法，但利用 此方法细胞的裂解率较低，并且液不适用于大量细胞的裂解(超出50 g)。无论选择 何种方法，都必须将细胞置于冰上； 细胞裂解后在混和液中迅速加入蛋白酶抑制剂，每40 mL混和液加入5mL的含有 EDTA的蛋白酶抑制剂Cocktail Set II或lmL的蛋白酶抑制剂Cocktail Set III (选 做)；
10000 rpm离心lOmin收集包涵体；
弃上清，将沉淀(内有包涵体)用0.1倍菌液体积的1 xIB洗涤液完全重悬；
⑦ 重复步骤5收集沉淀；
⑧ 将上述沉淀再次用0.1倍菌液体积的1 x IB洗涤液完全重悬，并将重悬液转移至重 量已知的干净的离心管中；
⑨ 10000rpm离心10min收集包涵体，弃上清，并将离心管倒置在纸巾上以完全除去 多余的液体；
⑩ 离心管称重，减去管中以得到包涵体的净重。 一般来说，OD600为3时收集的菌液， 并且不溶性蛋白在细胞中的含量为10-40%时，每毫升菌液中有l-4mg的包涵体。
2)蛋白的溶解和重新折叠
①根据包涵体的重量计算所需的溶解液量，溶解包涵体使其在溶解液中的浓度为10-20 mg/ml，溶解液按如下配方在室温下配制
10 x IB Solubilization buffer 5 mL
ddH20 44.5 mL
30% N-lauroylsarcosine 0.5 mLDTT 50
Total 50 mL
② 将配制的溶解液加入收集有包涵体的离心管中，轻微混和。大的片断用枪头反复打 碎；
③ 室温静置15min;
室温10000 rpm离心10 min离心，转移上清(内有溶解蛋白)于干净的离心管中 (避免碎片)。
3)透析
①透析袋处理，过程如下
a把透析袋剪成适当长度(10-20 cm)的小段；b 在大体积的2% (W/V)碳酸氢钠和lmmol/LEDTA (pH8.0)中将透析袋煮 沸10min;
C 用蒸馏水彻底清洗透析袋；
d 放在lmmol/LEDTA (pH8.0)中将之煮沸10min。
冷却后，存放于4'C，
必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋必须戴手套； e用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净；
② 准备透析液(为样品的50倍，如样品量为15mL，则需透析液750 mL，因透析两 次故共需透析液1.5 L)，按以下配方配制
50 x IB dialysis Buffer 30 mL
ddH20 1.5 L
(1MDTT ) 150
③ 4°C透析至少3h以上，换新的透析液继续透析3h以上； 按上步骤制备透析液，但不加DTT;
⑤用不加DTT的透析液再透析一次。 4)氧化还原以促使二硫键的形成
为促使蛋白的二硫键的正确形成，可以在透析液中加入氧化剂和还原剂继续透析，经 常用的氧化还原剂为氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽，比较经济的方法是使用CuS04或 NaSe03,但使用这种方法所形成的不正确的二硫键比前者高。因此本论文中使用氧化性谷胱 甘肽和还原性谷胱甘肽。
① 如上制备透析液，但加入氧化还原剂，于4°C保存(其中还原性谷胱甘肽和氧化性 谷胱甘肽的浓度分别为ImM和0.2 mM);
② 继续于4°C透析蛋白过夜；
③ 如有必要，继续于室温或37°C透析蛋白以提高二硫键的形成率，最后得到复性蛋白 液。
另有一种替代的方法就是配制氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽的浓縮液，并直接加 到目标蛋白中，反应后透析再除去多余的氧化还原剂.
复性完成后对复性蛋白进行SDS-PAGE分析，如图5、图6所示，表明复性蛋白是较
纯的几丁质酶ChiA和ChiB。
3.酶活性的测定方法。
酶活力测定采用改良的还原糖法，其原理为可溶性壳聚糖酶解后释放出还原糖，还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应变色，于分光光度计550 nm处测定其光吸收值，以N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)为标准糖，制作标准曲线。
酶活力(单位U)定义为在37 'C反应条件下，每分钟释放lpg还原糖所需要的酶量 为l个酶活力单位(U/mL)。 (l)NAG标准曲线的绘制
取7支25mL刻度的试管，按表加入各种试剂，振荡混匀，在沸水浴加热10min，随即 放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加20mL水稀释，混匀，在550nm波长下测OD值。以 OD550值为纵坐标，NAG量(mg)为横坐标，绘制标准曲线，其标准曲线如图7所示。
管号0123456
NAG标准液(ml)00.20.40.60.81.01.2
蒸馏水(ml)2.01.81.61.41.21.00.8
DNS试剂(ml)3.03.03.03.03.03.03.0
相当NAG量(mg)00,20.40.60.81.01.2
(2) 样品处理测定取25 mL试管加入1 mL胶体几丁质和1 mL复性蛋白(几丁质酶ChiA、 几丁质酶ChiB或者ChiA和ChiB的组合(体积比l: 1、 1: 2、 2: 1)，振荡混均后于 37 X:水浴中反应10min，立即进入沸水浴1 min灭活，冷却至室温；加入3.0 mLDNS 试剂，振荡混匀，沸水浴加热10min，冷却至室温，于分光光度计550 nm处测定光吸 收值，对照NAG标准曲线计算出还原糖含量，折算成酶活力单位，重复三次。测试结 果表明含有几丁质酶ChiA的蛋白复性液的酶活为15.9U/ml，含有几丁质酶ChiB的蛋 白复性液的酶活为14.5 U/ml，按体积比1: 1、 1: 2、 2: 1混合的几丁质酶ChiA和ChiB 的组合液的酶活分别为34.8U/ml、 29.4 U/ml、 30.2 U/ml。
(3) 各种试剂的制备
酶活力测试的NAG标准液为1 mg/mL，制备方法称O.lg N-乙酰葡萄糖胺于适量水中 溶解，转移至100mL容量瓶定容，即得lmg/mL标液。
酶活力测试的DNS试剂的制备方法取3， 5-二硝基水杨酸6.3 g，加入2 mol/L的NaOH 溶液262 mL加至500 mL含185 g酒石酸钾的热水中，再加入结晶酚和亚硫酸钠各5 g，搅拌 混匀加蒸馏水定容至1000 mL。
酶活力测试的胶体几丁质的制备方法在1(TC下，将几丁质5g放入研钵中，加丙酮40 mL研磨10min。边研磨边缓缓加入预冷浓HC1 200 mL，充分研磨，使呈糊状，于4。C放置 24 h。用玻璃棉过滤，将滤液缓缓加入到盛有1000 mL 50%乙醇(v/v)的烧杯中，边加边剧烈搅拌，然后静置，待胶体几丁质析出后去除清液，收集胶态几丁质。用蒸馏水冲洗胶态几 丁质至pH7，以蒸馏水定容至500mL,冷藏备用。
复性蛋白的SDS-PAGE分析和酶活测定表明，几丁质酶ChiA和几丁质酶ChiB的编码基 因表达了几丁质酶，并且经过复性，得到了具有活性的几丁质酶ChiA和几丁质酶ChiB。 4.复性蛋白的浓度测定
本论文利用考马斯亮蓝法对蛋白的浓度进行测定，具体过程如下
(1) 在离心管中分别加入0.5mg/mL的BSA5pL、 10 pL、 15 pL、 20 pL，以0.15 mM/L 的NaCl补足至200 nL，以200 pL的0.15mM/L的NaCl作为空白对照；
(2) 每管加入2mL考马斯亮蓝G-250，振荡混匀，室温放置2 min;
(3) 用lcm光径的比色杯测BSA的A595，用A595对BSA标准蛋白的浓度作图并绘制 标准曲线；
(4) 取50 nL的待测蛋白稀释为2mL并测定其八595，利用BSA的标准曲线确定待测蛋 白的浓度。
利用考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度，并绘制BSA的标准曲线如图8所示，计算后几丁 质酶A的复性蛋白浓度为2.05吗年L，几丁质酶B的复性蛋白浓度为1.95pg尔L。 三、重组表达几丁质酶ChiA， ChiB对蜜蜂狄斯瓦螨的毒杀作用测定。
将上述步骤二中得到的重组表达的几丁质酶ChiA， ChiB的复性蛋白液，分别测定以下 五种方式的复性蛋白液对蜜蜂狄斯瓦螨的毒杀作用(l)几丁质酶ChiA的复性蛋白液；(2)几 丁质酶ChiB的复性蛋白液；(3)几丁质酶ChiA复性蛋白液和几丁质酶Ch氾复性蛋白液，按 体积比1: 1混合的组合液；(4)几丁质酶ChiA复性蛋白液和几丁质酶ChiB复性蛋白液，按 体积比l: 2混合的组合液；(5)几丁质酶ChiA复性蛋白液和几丁质酶ChiB复性蛋白液，按 体积比2: l混合的组合液； 1.生物测定的方法如下
参照(TsagoueM/.,2004)的方法，并有所修改。
(1) 从被大蜂螨感染的意蜂蜂群中取回巢脾，尽量从多个蜂箱中取。
(2) 采集蜂螨的方法用镊子打开巢脾上的蜂房，用毛笔或者小刷子轻轻从幼虫和蛹上收集
大蜂螨。
(3) 准备9 cm的一次性培养皿，并在底部各铺一张灭好菌的滤纸，每个培养皿中放4只工 蜂的白眼蛹作为大蜂螨的食物来源。
(4) 将收集到的大蜂螨放入培养皿中(一个培养皿中放20头)收集到后的一个小时内进行领啶。(5) 测定时采用浸泡的方法用毛笔尖挑起蜂螨，并将蜂螨完全浸没在lmL的几丁质酶复 性蛋白溶液(1.5mL离心管)中10 s，处理完毕后将蜂螨放回装有蜂蛹作为食物的培养 皿中饲养。
(6) 如果在处理的过程中发生蜂螨死亡的情况，则将该蜂螨弃去不用。每个处理重复3次。
(7) 对照组使用蛋白溶解液，透析液处理大蜂螨，重复3次。
(8) 培养皿置于黑暗的培养箱(RQH — Ol人工气候箱)中，温度和湿度控制在32°C， 80%RH。
(9) 每天记录和观察大蜂螨的存活情况。使用毛笔尖刺激螨，如果螨对刺激没有反应，则认 为螨己经死亡。如果发现蜂蛹有死亡的情况也要及时更换。
2.生物测定的结果如下
几丁质酶的活力测定数据显示，几丁质酶ChiA, ChiB活力分别为15.9U/mL， 14.5 U/mL， 当几丁质酶ChiA和ChiB组合时，几丁质酶的活力提高了很多，体积比为l: l的情况下达 到了 34.8 U/ml，体积比为1: 2禾P 2: 1其酶活分别达到了 29.4U/ml和30.2U/ml。对螨进行 的生物测定结果显示(图9)，当单独施用几丁质酶ChiA, ChiB处理蜂螨时(几丁质酶活力 分别为15.9 U/mL， 14.5 U/mL)， 5天后蜂螨的死亡率分别为40%， 40%。当测定几丁质酶ChiA 和ChiB按照体积比l: 1 (34.8 U/mL)、 1: 2 (29.4U/ml)、 2: 1 G0.2U/ml)组合后，在5 天后，蜂螨的死亡率分别达到了 93.3%、 83.3%和85.2%，组合酶与单独使用几丁质酶(ChiA 或者ChiB)相比差异显著，说明几丁质酶ChiA和ChiB协同效应，其组合后的几丁质酶活力 和杀螨能力得到了显著的提高，因此如果将本发明所述的几丁质酶ChiA， ChiB的编码基因 转入同一或者不同的工程菌中、转入蜜蜂中，或者将两种几丁质酶融合后转入工程菌或者蜜 蜂等目标生物当中，实现两种酶同时被用于防治蜜蜂的螨害，从而达到安全、高效的防治螨 害。序列表
<110>广东省昆虫研究所
<120>具有杀狄斯瓦螨活性的组合几丁质酶及其应用
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权利要求
1.一种具有杀狄斯瓦螨(Varroa destructor Anderson&Trueman)活性的组合几丁质酶，其特征在于该组合几丁质酶含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的几丁质酶ChiA和如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列编码的几丁质酶ChiB。
2. 根据权利要求1所述的组合几丁质酶，其特征在于所述几丁质酶ChiA酶活力为15.9 U/mL，所述的几丁质酶ChiB的酶活力为14.5U/mL，所述的组合几丁质酶是上述几丁质 酶ChiA与几丁质酶ChiB的按照体积比为1: 2~2: 1混合而成。
3. 根据权利要求2所述的组合几丁质酶，其特征在于所述的组合几丁质酶是几丁质酶ChiA 和几丁质酶ChiB按照体积比1: 1混合而成。
4. 权利要求1所述的组合几丁质酶在杀狄斯瓦螨中的应用。
全文摘要
本发明公开了具有杀狄斯瓦螨活性的组合几丁质酶及其应用，该组合几丁质酶包括几丁质酶ChiA和ChiB。本发明从粘质沙雷氏菌GEI的基因组DNA中克隆出一段基因碱基序列，应用原核表达载体pET-32a(+)，在大肠杆菌中表达该基因，对该基因的编码蛋白进行纯化、复性、生物测定表明，该蛋白对狄斯瓦螨具有毒性，几丁质酶活力为14.5U/mL的条件下，沾染该蛋白的狄斯瓦螨，5天后死亡率为40％。经过测序分析表明，该基因是一个几丁质酶基因chiB的新序列。应用同样的方法克隆到一个对狄斯瓦螨具有毒性的几丁质酶基因chiA类的新序列，实验证实几丁质酶ChiA和ChiB之间具有协同效应。本发明可组合用于蜜蜂的螨害防治。
文档编号C12N9/42GK101613685SQ20091003964
公开日2009年12月30日 申请日期2009年5月20日 优先权日2009年5月20日
发明者爽 涂, 韩日畴 申请人:广东省昆虫研究所