专利名称：一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测基因突变的荧光定量PCR试剂盒 及其检测方法，特别涉及一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
Ras癌基因参与人类肿瘤的发生发展，最初是在急性转化性逆转录病毒实验中从 Harvey、Kirsten两株大鼠肉瘤病毒中克隆出来的转化基因，自1982年Weinberg等人发 现人的膀胱癌细胞中有活化的H-ras基因后，引起了人们对ras癌基因在人类肿瘤发生发 展过程中所起的作用的极大关注。ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——H-ras, K-ras和N-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。其中，K-Ras则对人类癌症影响最大， 它好像分子开关当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生 长，并阻止细胞自我毁灭。研究人员发现K-Ras蛋白并不是永远位于细胞膜上，它的位置受 到蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的控制。他们发现PKC使磷酸分子与K_Ras结合即 磷酸化，这种磷酸化过程导致K-Ras与细胞膜的结合减弱而改变位置，并移至内质网、高尔 基体和粒线体等位置。K-Ras 基因突变不但导致非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC, 30%由K-Ras基因突变引起)，还诱发结肠癌和胰腺癌。KRAS基因突变发生在肿瘤恶变 的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致。大肠癌患者KRAS突变率为 30%-35%,而没有发生突变的正常kras基因占大多数，约60%。所有转移性结直肠癌患 者都应检测KRAS基因状态，只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂治疗。一是所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态，二是只有KRAS野生型患 者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗和帕尼单抗(包括单药或与化疗联合)治疗。那 么，KRAS对临床实践的影响究竟有多大？美国乔治敦大学马歇尔一言以蔽之在结直肠癌 的治疗中，结直肠癌从此“一分为二”:KRAS基因是野生型还是突变型，使传统意义上的一种 疾病被分成两种独立的疾病。KRAS突变型结直肠癌患者约占40 %，这类患者不能从抗EGFR 治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用；而其余60%左右的KRAS野生型患者就很 有可能从这类药物治疗中获益。靶向治疗已经成为肿瘤临床治疗的重要手段。表皮生长因子受体(EGFR)是靶向 治疗的主要作用靶点。FDA已经批准的作用于EGFR的靶向药物包括抗EGFR单克隆抗体药爱 必妥(Erbitux/ 西妥西单抗 /Cetuximab，默克)、帕尼单抗(Panitumumab/Vectibix, Amgen 和尼妥珠单抗(Nimotuzumab)，以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂易瑞沙(Iressa/吉非替尼/ Gefitinib，阿斯利康)和特罗凯(Tarceva/厄罗替尼/Erlotinib，罗氏制药)。但是，临床 试验表明这些靶向药物仅对部分病人有显著疗效。进一步的研究发现肿瘤组织中KRAS基 因发生突变(体细胞突变)的病人对此类靶向药物完全耐药。因此，检测病人KRAS基因是 否突变成为决定能否使用EGFR靶向药物的必要前提条件。
目前，检测K-Ras基因突变的方法是传统的直接测序法。直接测序法的结果虽然 具有客观性和特异性，但是它却存在以下缺点1、检测周期长(从标本送检到得出结果最短要24-48个小时左右)。2、操作过程复杂，且要涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理
术g
；o3、测序结果的判读较复杂、费时(当样本量大时，此点尤为突出)。4、检测的敏感性不够高KatSuhiko等人曾在2005年8月份出版的《Lung Cancer))(《肺癌》)上报道，如果突变基因的含量占基因组DNA总量的10%以下时，则用直 接测序法检测不到突变样本的存在。5、一次实验检测的样本量有限，最多只能8-24例。6、不安全整个实验过程要用到多种有毒物质，如EB、丙烯酰胺等，对操作者和环 境都有危害。7.费用较高(每个位点约需200元)。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明的目的之一是提供一种K-Ras基因突变分型荧光定 量PCR检测试剂盒。本发明的K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR混合反应液、肽 核酸(PNA)探针、突变型KRas-Allglo 荧光探针和阳性对照样品。所述肽核酸探针的序列如SEQ ID NO AO所示SEQ ID NO AO :PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，。所述PCR混合反应液中含PCR正向引物和PCR反向引物，所述PCR正向引物的序 列如SEQ ID NO A1所示，所述PCR反向引物的序列如SEQ ID NO A2所示SEQ ID NO A1 :5，-TTA GCT GTA TCG TCA AGG CAC TC-3，；SEQ ID NO A2 :5，-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3，。所述突变型KRas-Allglo 荧光探针包括如 SEQ ID NO A3、SEQ ID N0A4、SEQ ID NO A5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5、SEQ IDN0 B6 所示的序列中的一种或 多种SEQ ID NO A3 (GAT-12 密码子)SEQ ID NO A4 (GTT-12 密码子)SEQ ID NO A5 (GCT-12 密码子)SEQ ID NO B3 (GAC-13 密码子)SEQ ID NO B4 (TGT-12 密码子)SEQ ID NO B5 (AGT-12 密码子)SEQ ID NO B6 (CGT-12 密码子)
5’ -MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3‘； 5， -JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3' 5， -SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3，； 5’ -MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3' 5，-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3' 5’ -URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3‘； 5， -SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3，当所述突变型KRas-Allglo 荧光探针包括如SEQ ID NO A3,SEQ ID N0A4、SEQ ID NO A5所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照样品是存在K-Ras基因第12号密码子 三种突变类型(GAT，GTT和GCT)的混合质粒基因组DNA。该突变型KRas-Allglo 荧光探针 检测的是K-Ras基因第12密码子三种碱基置换突变(GGT — GAT，GGT — GTT，GGT — GCT)。
当所述突变型KRas-Allglo 荧光探针包括如SEQ ID NO B3、SEQ ID N0B4、SEQ ID NO B5和SEQ ID NO B6所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照样品是存在K_Ras基因 第13号密码子一种突变类型(GAC)和第12密码子三种突变型(TGT、AGT和CGT)的混合质 粒基因组DNA。该突变型KRas-Allglo 荧光探针检测的是K_Ras基因第13密码子一种碱 基置换突变(密码子13GGC — GAC)，第12密码子三种碱基置换突变(密码子12GGT — TGT， GGT — TGT 禾口 GGT — CGT)。 本发明的第二个目的是提供一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测方法。该 方法具体是先针对K-Ras基因设计一对PCR引物和肽核酸探针，针对K-Ras基因突变位点 分别设计Allglo 荧光探针，反应体系中加入PCR反应液、PCR引物、肽核酸探针和Allglo 荧光探针进行荧光定量PCR的检测。所述的肽核酸探针的序列如SEQ ID NO AO所示SEQ ID NO AO :PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，。所述的PCR 引物如 SEQ ID NO A1 和 SEQ ID NO A2 所示SEQ ID NO A1 :5，-TTA GCT GTA TCG TCA AGG CAC TC-3，；SEQ ID NO A2 :5，-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3，。所述的Allglo 荧光探针包括如 SEQ ID NO A3,SEQ ID NO A4、SEQ ID N0A5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5 和 SEQ ID NO B6 所示的序列中的一种或多种。SEQ ID NO A3 (GAT-12 密码子)SEQ ID NO A4 (GTT-12 密码子)SEQ ID NO A5 (GCT-12 密码子)SEQ ID NO B3 (GAC-13 密码子)SEQ ID NO B4 (TGT-12 密码子)SEQ ID NO B5 (AGT-12 密码子)SEQ ID NO B6 (CGT-12 密码子)
5’ -MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3‘； 5， -JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3' 5， -SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3，； 5’ -MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3' 5，-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3' 5’ -URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3‘； 5， -SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3，其中，SEQID NO A3、SEQ ID NO A4、SEQ ID NO A5 是检测 K-Ras 基因第 12 密码 子三种碱基置换突变(GGT — GAT, GGT — GTT, GGT — GCT) ；SEQ IDN0 B3、SEQ ID NO B4、 SEQ ID NO B5和SEQ ID NO B6是检测K-Ras基因第13密码子一种碱基置换突变(密码 子13GGC — GAC)，第12密码子三种碱基置换突变(密码子12GGT — TGT，GGT — AGT和 GGT — CGT)。Allglo 荧光探针SEQ ID NO A3的5'和3，端均标记MAR(荧光报告/淬灭基 团)；Allglo 荧光探针SEQ ID NO A4的5'和3，端均标记JUP(荧光报告/淬灭基团)； Allglo 荧光探针SEQ ID NO A5的5'和3，端均标记SAT (荧光报告/淬灭基团)。Allglo 荧光探针SEQ ID NO B3的5'和3，端均标记MAR(荧光报告/淬灭基团)；Allglo 荧光 探针SEQ ID NO B4的5'和3，端均标记JUP(荧光报告/淬灭基团)；Allglo 荧光探针 SEQ ID NO B5的5'和3，端均标记URA(荧光报告/淬灭基团)。Allglo 荧光探针SEQ ID NO B6的5'和3，端均标记SAT(荧光报告/淬灭基团)。优选的，反应体系之一包括(l)PCR混合反应液、(2)肽核酸(PNA)探针、(3)突变 型KRas-Allglo 荧光探针和⑷阳性对照样品。该体系检测的是K-Ras基因第12密码子 三种碱基置换突变(GGT — GAT, GGT — GTT, GGT — GCT)。
其中，(1) PCR混合反应液中含PCR正向引物和PCR反向引物，PCR正向引物的序列 如 SEQ ID NO A1 所示:SEQ ID NO A1 :5，_TTA GCT GTA TCGTCAAGG CAC TC_3，;PCR 反向引 物的序列如SEQ ID NO A2所示:SEQ ID N0A2 :5，_GCC TGC TGA AM TGA CTG AAT ATA-3，。(2)肽核酸探针抑制K-Ras基因突变区野生型基因扩增的PNA序列，其序列如SEQ ID NO AO 所示:SEQ ID NO AO :PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，。(3)突变型 KRas-Allglo 荧光探针包括如 SEQ ID NO A3、SEQ ID N0A4、SEQ ID NO A5所示的序列SEQ ID NO A3 (GAT-12 密码子)5，-MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3，；SEQ ID NO A4 (GTT-12 密码子)5，-JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3，；SEQ ID NO A5 (GCT-12 密码子)5，-SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3，；(4)阳性对照样品是存在K-Ras基因第12号密码子三种突变类型(GAT，GCT和 GTT)的混合质粒基因组DNA。优选的，反应体系也可以为包括(l)PCR混合反应液、⑵肽核酸(PNA)探针、(3) 突变型KRas-Allglo 荧光探针和⑷阳性对照样品。该体系检测的是K-Ras基因第13密 码子一种碱基置换突变(密码子13GGC — GAC)，第12密码子三种碱基置换突变(密码子 12GGT — TGT, GGT — AGT 和 GGT — CGT)。其中，(1) PCR混合反应液中含PCR正向引物和PCR反向引物，PCR正向引物的序列 如 SEQ ID NO A1 所示:SEQ ID NO A1 :5，_TTA GCT GTA TCGTCAAGG CAC TC_3，;PCR 反向引 物的序列如 SEQ ID NO A2所示:SEQ ID N0A2 :5，_GCC TGC TGA AM TGA CTG AAT ATA-3' (2)肽核酸探针的序列如SEQ ID NO AO所示SEQ ID NO AO :PNA probe-5' -CCTACGCCACCAGCTCC-3’。(3)Allglo 荧光探针包括如 SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID N0B5、SEQ ID NO B6所示的序列SEQ ID NO B3 (GAC-13 密码子)5，-MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3，；SEQ ID NO B4 (TGT-12 密码子)5，-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3，；SEQ ID NO B5 (AGT-12 密码子)5，-URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3，；SEQ ID NO B6 (CGT-12 密码子)5，-SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3，；(4)阳性对照样品是存在K-Ras基因第13号密码子一种突变类型(GAC)和第12 密码子三种突变型(TGT，AGT和CGT)的混合质粒基因组DNA。优选的，反应体系为15 u 1,PCR引物各0. 15 ill (终浓度20 u M), Allglo 荧光探 针探针各0. 2 ill (终浓度20 ii M)，PNA探针0. 3 ill (终浓度20 y M)，模板DNA 2. 5 u 1 (终 浓度 100-300ng/u 1), PCR 反应液 7. 5 yl，加入 ddH20 至 15 yl。综合Allglo 探针的优势和定量PCR技术特点，与PCR-SSCP测序等方法比较，本 技术用PNA增敏的FQ-PCR检测K-Ras基因的突变具有以下优势1、特异性强设计的Allglo 探针分别针对KRAS基因第12和第13密码子的七种 特异突变序列，能特异的与PCR扩增的特异突变产物杂交；Allglo 探针提高TM值(可高 达10°C以上)，可以抑制非特异性PCR产物扩增；另外本发明技术在PCR反应液中加入野生 型K-Ras基因肽核酸序列(PNA)，通过抑制野生型基因组产物扩增而富集突变型扩增，也提 高检测的特异性；
2、检测敏感性高本发明技术在PCR反应液中加入野生型K-Ras基因肽核酸序列 (PNA)，通过抑制野生型产物扩增富集突变型扩增，提高检测敏感性；由于探针更短，可以达 到15-16mer ；Allglo 探针两端荧光即可相互粹灭，水解后又可报告荧光，也提高了检测灵 敏度。本技术检测K-Ras突变基因组DNA敏感度为(即突变基因组DNA达到基因总 DNA的即可检出)；直接测序法检测K-Ras突变基因组DNA敏感度为20-30% (即突变 基因组DNA达到基因总DNA的20-30%才能检出)；表1列示不同检测方法对结直肠癌组织 K-Ras基因突变检测的灵敏度表 1 3、可以进行KRAS突变型基因组定量检测；测序和其它方法均不能实现对K-Ras基 因突变基因组的真正定量检测；4、本技术对标本DNA获取的质量要求较低，无论是石蜡组织还是新鲜组织，都能 取得理想的检测结果；直接测序法一般需要新鲜冰冻组织，检测步骤繁琐送检标本-提取 DNA-定性PCR扩增-验证PCR产物-纯化PCR产物-直接测序；5、检测时间短(从标本送检到得出结果可在3个小时以内完成)；测序方法最快 需要24-48小时才能出结果；6、操作过程简单，并且从PCR反应开始，就是在封闭的体系中完成扩增和实时测 定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了结果偏差的几率(比较如下所示)。7、结果判读明确、直观(比较如下所示)；若需要亦可对结果进行定量分析。直接 测序法结果的判读需将测序峰形图人工读出序列，再将所读出的序列结合基因库中的原 始序列一起分析，从而得到结果，荧光定量PCR法结果的判读在域值线以上有扩增曲线的 标本均为阳性标本，结果判读非常简单，直观。8、检测的样本量大，一次最多可检测384例；直接测序法一次试验最多可检测 8-12 例。9、安全整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。本发明的试剂盒能快速、准确、高敏感度的检测各种癌组织中K-Ras基因特定位 点突变。本发明采用了 PNA技术合成覆盖K-Ras基因检测位点(第12和13密码子)的肽核酸序列，结合采用了最新发展的Allglo 荧光探针技术。肽核酸(PNA，Peptide Nucleic Acid)是近十几年发展起来的以中性酰胺键为骨 架的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid, DNA)类似物，以中性酰胺键为骨架并兼有多 肽和核酸性质的独特化合物，其特点是1、可以高度亲和并序列特异地与DNA和RNA结合， 与核酸的杂交能力强于核酸间的杂交能力，形成的杂交复合物具有相当高的热稳定性以及 独特的耐离子强度变化性质；2、热稳定性高于核酸间的杂交体；3、抗酶解能力极强，由于 其非肽和非核酸的结构特点，蛋白酶和核酸酶均不能降解PNA。目前，PNA被广泛用于化学、 生物学、反义药物、分子识别、遗传诊断等领域。它能够与DNA和RNA特异性地结合从而可 以制备PNA探针，与DNA探针相比，其杂交的稳定性和特异性增加且能在低盐浓度下进行杂 交，可大大提高微生物学检测和医疗诊断的效率和灵敏度。Allglo 探针是美国AlleLogic Biosciences公司推出的最新一代荧光定量探 针，它拥有普通Taqman、Taqman-MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，去掉 了目前这几种探针的最大弊端，能够大大提高荧光定量PCR技术的研究和应用。Allglo 探针打破传统Taqman探针的一端报告基团一端粹灭基团的限制，利用美 国AlleLogic Biosciences公司生物化学专家大量研究开发的、获得美国专利技术的几种 常用波长的特制荧光染料，该系列染料标记在oligo上面互相互为报告及粹灭基团，而且 上面含有特殊的可以大大提高TM值的化学基团，可以大大提高探针特异性，经同类比较， 杂交特异性大大超过Taqman及Taqman-MGB，在杂交水解之后两端标记的染料又全部变为 报告基团，大大提高荧光增量。其优势在于，可提高TM值(可高达10°C以上)，探针更短， 可以15-16mer，可以适用于A、T含量比较高的序列设计探针，大大提高探针配对和非配对 的TM值差异，加大多重荧光定量PCR的选择5-7种专利荧光选择，适用于所有品牌荧光定 量PCR仪所有通道；每种染料即是报告基团又是粹灭基团，打破传统Taqman探针，因为波长 原因标记选择困难，不受粹灭基团波长的限制；提高信噪比无背景荧光，空间距离近，更 好的淬灭效果，探针两端荧光即可相互粹灭，水解后又可报告荧光。本发明的肽核酸(PNA)和Allglo 探针增敏的K-Ras基因突变荧光定量PCR检测 试剂盒是针对K-Ras基因热点突变区的检测而设计的，包括K-Ras基因第12、13密码子的 共7种突变基因型。该试剂盒包括PCR混合反应液、优选的，包括两种荧光定量反应液，荧光 定量反应液的特征是均含有正、反引物和Allglo 荧光探针，抑制KRAS突变区野生型基因 组PCR扩增的PNA序列，阳性对照样品，只是Allglo 荧光探针针对的突变位点有所区别， 相应的阳性对照样品也有所不同而已。在本发明中，提供的两端都标有荧光发光基团MAR的特异性荧光探针，在探针完 整时(随机状态和无PCR产物杂交状态)，则探针两端MAR荧光染料均不发出荧光。当特异 的PCR产物与Allglo 探针发生杂交反应时，Taq酶同时也把探针裂解，则探针两端标记的 MAR荧光染料改变为杂交消化形态而发出荧光。由于标记Allglo 探针两端的MAR互相互 为报告及粹灭基团，而且上面含有特殊的可以大大提高TM值的化学基团，可以大大提高探 针特异性，经同类比较，杂交特异性显著超过Taqman及Taqman-MGB，在杂交水解之后两端 标记的染料又全部变为报告基团，大大提高荧光增量。报告基团所释放出来的荧光就可以 被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一 样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
图1是用荧光定量PCR检测肠癌阳性样本的KRAS基因第12密码子三种碱基置换 突变的扩增曲线图；图2是用荧光定量PCR检测肠癌阳性样本的KRAS基因第13密码子一种碱基置换 突变和第12密码子两种碱基置换突变的扩增曲线图。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。收集临床病理诊断为肠腺癌(CRC)的80例患者的蜡块组织，所有患者术前均未接 受过西妥昔单抗(cetuximab)治疗。从蜡块中提取基因组DNA供以下的实验应用。实施例1 用荧光定量PCR(FQ-PCR)检测KRAS基因第12密码子四种碱基置换突 变(密码子 I2GGT — GAT，GGT — GTT，GGT — GCT)。设计能特异性检测上述三种碱基置换突变的特异性Allglo 荧光定量检测探针 各一条及PCR引物一对，各探针、引物序列分别具体如下PNA 序列为 PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，，如序列表中 SEQID NO AO 所 示； 针对GAT-12密码子的突变型KRAS-Allglo 荧光定量检测探针序列为 5，-MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3，，如序列表中 SEQ ID NO A3 所示；针对GTT-12密码子的突变型KRAS-Allglo 荧光定量检测探针序列为 5，-JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3，，如序列表中 SEQ ID NO A4 所示；针对GCT-12密码子的突变型KRAS-Allglo 荧光定量检测探针序列为 5，-SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3，，如序列表中 SEQ ID NO A5 所示；PCR 正向引物序列为:5，-TTA GCT GTA TCG TCAAGG CAC TC-3，，如序列表中 SEQ ID NO Al 所示；PCR反向引物序列为5'-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3，，如序列表中 SEQ ID NO A2 所示。其中，PNA序列是抑制K-Ras基因突变区野生型基因扩增，针对GAT-12密码子的突 变型KRAS-Allglo 荧光定量检测探针的5’和3’端均标记MAR(荧光报告/淬灭基团)；针 对GTT-12密码子的突变型KRAS-Allglo 荧光定量检测探针的5’和3’端均标记JUP (荧 光报告/淬灭基团)；针对GCT-12密码子的突变型KRAS-Allglo 的荧光定量检测探针的 5’和3’端均标记SAT (荧光报告/淬灭基团)。阳性对照样品是存在K-Ras基因第12号 密码子3种突变类型(GAT，GCT和GTT)的混合质粒基因组DNA。优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15 μ 1，PCR正向引物和PCR反 向引物各0. 15μ1(终浓度20μΜ)，三种突变型KRAS-Allglo 的荧光定量检测探针 各0. 2 μ 1 (终浓度20 μ M)，PNA探针0. 3 μ 1 (终浓度20 μ M)，模板DNA 2. 5 μ 1 (终浓 度100-300ng/y 1)，PCR反应混合液(CS PCR Master Mix，购自上海超市生物技术公 司)7. 5 μ 1，补加ddH20至总体积为15 μ 1。荧光定量反应在ΑΒΙ7900检测仪上进行。反应条件为95 °C变性5分钟，95 °C 30秒，60 V 30秒，72 °C 1分钟，扩增反应40循环。结果为在80例样本中共检测出9例样本发生KRAS基因第12密码子GGT — GAT 突变，5例样品发生KRAS基因第12密码子GGT — GTT突变，2例样本发生KRAS基因第12密 码子GGT — GCT突变。部分阳性样本见图1，图IA示KRAS基因第12密码子GGT — GAT突 变的部分样品阳性扩增曲线；图IB示KRAS基因第12密码子GGT — GTT突变的部分样品阳 性扩增曲线；图IC示KRAS基因第12密码子GGT — GCT突变的部分样品的阳性扩增曲线。实施例2 用荧光定量PCR检测KRAS基因第13密码子一种碱基置换突变(密码子 13GGC — GAC)，第12密码子三种碱基置换突变(密码子12GGT — GCT，GGT — AGT，GGT — CGT)设计能特异性检测上述四种碱基置换突变的特异性Allglo 荧光定量检测探针 各一条及PCR引物一对，各探针、引物序列分别具体如下PNA 序列为 PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，，如序列表中 SEQID NO AO 所 示；针对GAC-13密码子的突变型KRAS-Allglo 荧光定量检测探针序列为 5，-MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3，，如序列表中 SEQ ID NO B3 所示；针对TGT-12密码子的突变型KRAS-Allglo 荧光定量检测探针序列为 5，-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3，，如序列表中 SEQ ID NO B4 所示；针对AGT-12密码子的突变型KRAS-Allglo 荧光定量检测探针序列为 5，-URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3，，如序列表中 SEQ ID NO B5 所示；针对CGT-12密码子的突变型KRAS-Allglo 荧光定量检测探针序列为 5，-SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3，；如序列表中 SEQ ID NO B6 所示；PCR 正向引物序列为5'-TTA GCT GTA TCG TCA AGG CAC TC-3，，如序列表中 SEQ ID NO Al 所示；PCR反向引物序列为5'-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3，，如序列表中 SEQ ID NO A2 所示。其中，PNA序列是抑制K-Ras基因突变区野生型基因扩增，针对GAC-13密码子的 突变型KRAS-Allglo 荧光定量检测探针B3的5，和3，端均标记MAR(荧光报告/淬灭基 团)；针对TGT-12密码子的突变型KRAS-Allglo 荧光定量检测探针B4的5’和3’端均标 记JUP (荧光报告/淬灭基团)；针对AGT-12密码子的突变型KRAS-Allglo 的荧光定量检 测探针B5的5’和3’端均标记URA(荧光报告/淬灭基团)。针对CGT-12密码子的突变型 KRAS-Allglo 的荧光定量检测探针的5’和3’端均标记SAT(荧光报告/淬灭基团)。阳 性对照样品B是存在K-Ras基因第13号密码子一种突变类型(GAC)和第12密码子三种突 变型(TGT，AGT和CGT)的混合质粒基因组DNA。优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15 μ 1，PCR正向引物和PCR反 向引物各0. 15μ 1(终浓度20μΜ)，四种突变型KRAS-Allglo 的荧光定量检测探针探 针各0. 2 μ 1 (终浓度20 μ M)，PNA探针0. 3 μ 1 (终浓度20 μ M)，模板DNA2. 5 μ 1 (终浓 度100-300ng/y 1)，PCR反应混合液(CS qPCR Master Mix，购自上海超市生物技术公 司)7. 5 μ 1，补加ddH20至总体积为15 μ 1。荧光定量反应在ΑΒΙ7900检测仪上进行。反应 条件为95 °C变性5分钟，95 °C 30秒，60 V 30秒，72 °C 1分钟，扩增反应40循环。结果为在80例样本中共检测出2例样本发生KRAS基因第13密码子GGC — GAC突变，1例样品发生KRAS基因第12密码子GGT — TGT突变，1例样本发生KRAS基因第12 密码子GGT — AGT突变。本组病例没有发现KRAS基因第12密码子GGT — CGT突变。部分 阳性样本见图2 图2A示KRAS基因第13密码子GGC — GAC突变的部分样品阳性扩增曲线； 图2B示KRAS基因第12密码子GGT — TGT突变的部分样品阳性扩增曲线；图2C示KRAS基 因第12密码子GGT — AGT突变的部分样品的阳性扩增曲线。上述结果表明本发明的FQ-PCR法检测肿瘤组织KRAS基因突变不仅是快速、高效 的，而且其结果的判读非常明确、直观，结果亦是可靠、特异的，结果可靠性的验证可见该实 验的实验数据。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。序列表<120> 一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法<160>10<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>17<212>DNA<213> 人工序列 AO<400>1cctacgccac cagctcc17<210>1<211>17<212>DNA<213> 人工序列 Al<400>2ttagctgtat cgtcaaggca ctc23<210>1<211>24<212>DNA<213> 人工序列 A2<400>3gcctgctgaa aatgactgaa tata24<210>1<211>14<212>DNA<213> 人工序列 A3<400>4
tggagctgat ggcg
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列A4
<400>5
gttggagctg ttggcgt
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列A5
<400>6
tggagctgct ggcgt
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列B3
<400>7
agctggtgac gtaggc
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列B4
<400>8
gttggagctt gtggcgt
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列B5
<400>9
tggagctagt ggcgt
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列B6
<400>10
ttggagctcg tggcgt
权利要求
一种K Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR混合反应液、肽核酸探针、突变型KRas AllgloTM荧光探针和阳性对照样品。
2.根据权利要求1所述的K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于， 所述肽核酸探针的序列如SEQ ID NO AO所示。
3.根据权利要求1所述的K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于， 所述PCR混合反应液中含PCR正向引物和PCR反向引物，所述PCR正向引物的序列如SEQ ID NO Al所示，所述PCR反向引物的序列如SEQID NO A2所示。
4.根据权利要求1所述的K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于， 所述突变型 KRas-AllgloTM 荧光探针包括如 SEQ ID NO A3、SEQID NO A4、SEQ ID NO A5、 SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5禾口 SEQ ID NO B6所示的序列中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于， 当所述突变型KRas-AllgloTM荧光探针包括如SEQ ID NO A3、SEQID NO A4和SEQ ID NO A5所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照样品是存在K-Ras基因第12号密码子三种 突变类型(GAT，GCT和GTT)的混合质粒基因组DNA。
6.根据权利要求4所述的K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于， 当所述突变型 KRas-AllgloTM 荧光探针包括如 SEQ ID NO B3、SEQID NO B4、SEQ ID NO B5 和SEQ ID NO B6所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照样品是存在K-Ras基因第13 号密码子一种突变类型(GAC)和第12密码子三种突变型(TGT、AGT和CGT)的混合质粒基 因组DNA。
7.一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测方法，其特征在于，针对K-Ras基因设计 一对PCR引物、肽核酸探针，并针对K-Ras基因突变位点分别设计AllgloTM荧光探针，反应 体系中加入PCR反应液、PCR引物、肽核酸探针和AllgloTM荧光探针进行荧光定量PCR的 检测。
8.根据权利要求7所述的一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测方法，其特征在 于，所述的肽核酸探针的序列如SEQ ID NO AO所示。
9.根据权利要求7所述的一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测方法，其特征在 于，所述的PCR引物如SEQ ID NO Al和SEQ ID NO A2所示。
10.根据权利要求7所述的一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测方法，其特征在 于，所述的 AllgloTM 荧光探针包括如 SEQ ID NO A3、SEQ ID N0A4、SEQ ID NO A5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5禾口 SEQ IDNO B6所示的序列中的一种或多种。
全文摘要
本发明提供了一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR混合反应液、肽核酸探针、突变型K-Ras-AllgloTM荧光探针和阳性对照样品。本发明还提供了一种K-Ras基因突变分型荧光定量PCR检测方法先针对K-Ras基因设计一对PCR引物和肽核酸探针，针对K-Ras基因突变位点分别设计AllgloTM荧光探针，反应体系中加入PCR反应液、PCR引物、肽核酸探针和AllgloTM荧光探针进行荧光定量PCR的检测。本发明采用了PNA技术，结合AllgloTM荧光探针技术，能快速、准确、高敏感度的检测各种癌组织中K-Ras基因突变位点，时间短、操作简单、判读明确、直观、安全。
文档编号C12Q1/68GK101899496SQ20091003980
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者石大陆 申请人:广州达健生物科技有限公司