一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法与流程

本发明属于于家禽肠道微生物检测
技术领域：
，具体地说，涉及一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法。
背景技术：
：动物消化道存在着数目庞大、相对稳定的微生物群落。菌群的多样性能够保证肠道微生物区系平衡。微生物群落能够维持胃肠道环境相对稳定，促进营养物质消化吸收。家禽的大肠很短，食糜会很快进入盲肠，所以盲肠是微生物生存和活动的重要场所。家禽肠道微生物分布，种类和数量的检测方法目前采用两种方法，一种是平板计数法，该法误差大，易污染，检测结果为活菌数，检测效果不好，并且耗时耗劳力。另一种是实时荧光定量pcr法，该方法灵敏度高，污染小，但依赖于标准品，检测菌种选择少，特异性不强。绝对定量pcr(absolutequantificationpcr，aq-pcr)技术是利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线，通过测定未知样品的ct值，从标准曲线上计算出该样品的起始浓度，实现了对测定样本基因的分子拷贝数的绝对定量。目前广泛应用的相对荧光定量pcr技术只是测定样本中的靶序列相对于参照样本量的变化，而不能测出初始模板起始拷贝数的绝对量。标准曲线的制备是绝对荧光定量pcr实验的关键步骤，目前家禽肠道微生物绝对定量pcr法多选择已知菌株为标准品，提取基因组制备标准曲线，测定样品时，标准品与未知样品同时进行pcr循环，根据未知样品的ct值，结合标准曲线来求得未知样品cdna的起始拷贝数。该方法会受到标准品的限制，检测菌种选择少，特异性不强，并且标准品菌株是利用平板计数法确定活菌数，存在较大误差。技术实现要素：有鉴于此，本发明针对家禽肠道微生物检测方法目前存在误差大，耗时，检测效果不好，检测菌种限制，特异性不强的问题，提供了一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法。为了解决上述技术问题，本发明公开了一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法，包括以下步骤：步骤1、dna提取：采用粪便基因组提取试剂盒，将肉鸡盲肠内容物总dna提取于1.5mlep管中，测其核酸浓度，灭菌超纯水稀释到20ng/μl，与原液一起保存于-20℃冰箱，待用；步骤2、合成肉鸡肠道微生物pcr引物；步骤3、构建肉鸡肠道微生物质粒；步骤4、制作标准品；步骤5、进行样品检测。进一步地，所述步骤3中构建肉鸡肠道微生物质粒具体为：1)以肉鸡肠道内容物总dna为模板，用步骤1中的引物进行pcr扩增，按照pcr反应体系扩增产物，琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶dna小量回收试剂盒回收纯化目的片段，测od值，-20℃保存；2)用试剂盒将1)中纯化的目的片段连结在载体上并转化，按照说明书制备10μl连接混合液，16℃，30min；1μl混合液加入10μldh5α冰上30min，做一个重复组；42℃热激90s，冰上3min；500μl的lb培养基，37℃，复苏45-60min，220rpm/min；4000rpm/min离心，2min，弃400μl，重悬，la平板上涂板，37℃过夜培养，不超过16h；3)挑取单菌落白斑，于10ul液体la培养基中，取1ul进行菌落pcr，剩下的加500ul的液体la培养基；pcr结果阳性的菌液测序；4)测序结果在blast上比对，阳性结果菌液发酵后试剂盒提取质粒；5)质粒测序，ncbi上blast比对结果，挑选与目的菌株匹配的质粒，检测dna浓度，保存于-20℃冰箱，备用。进一步地，所述步骤4中制备标准品具体为：将质粒按十倍稀释法，用灭菌超纯水稀释成10-1-10-9的浓度梯度，取9个无菌的1.5mlep管，根据浓度由大到小依次编号1-9，并各加入90μl灭菌的超纯水，取肉鸡肠道微生物标准质粒原液10μl于试管中，快速轻柔吹打20-30次，重复该步骤至9号ep管，得到包括原液的10个梯度的标准品。进一步地，所述步骤5中样品检测具体为：选取3-7号标准品与样品稀释液一起进行荧光定量pcr反应；试验所用设备为bio-rad96孔荧光定量pcr仪。进一步地，pcr反应的反应体系为上游引物和下游引物各0.8μl；rnase-freeddh2o7.4μl；sybrgreensupermix10μl；dna模板1μl。进一步地，所述荧光定量pcr反应的反应条件：预变性阶段，1次循环，温度95℃，预变性30s，不采集荧光信号；pcr反应阶段，40次循环，温度95℃，变性5s，退火温度50-60℃，时间30s，温度72℃，延伸20s，采集荧光信号；溶解曲线，72℃到95℃，每2s上升0.5℃。进一步地，所述肉鸡肠道微生物为总菌、乳杆菌或大肠杆菌中的一种。与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：1)本发明提供的肉鸡肠道微生物检测的方法采用的是荧光定量pcr方法，具有特异性高，重复性好，灵敏度高等特点；2)本发明通过利用肠道菌群的特异性保守基因片段插入载体构建质粒的方法，提高了菌种检测的准确性，解决了标准菌株做标准曲线的局限性；3)本发明通过对肉鸡肠道微生物的绝对定量，可以确定某种菌的绝对拷贝数，对肠道菌群多样性和丰度的分析提供了参考依据。本发明可以用于其他动物肠道微生物水平的检测。当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1是本发明实施例1中的肉鸡肠道乳杆菌绝对定量pcr标准曲线；图2是本发明实施例1中的乳杆菌质粒标准品实时定量pcr溶解曲线；图3是本发明实施例1中的扩增曲线；图4是本发明实施例2中的肉鸡肠道总菌数绝对定量pcr标准曲线；图5是本发明实施例2中的总菌质粒标准品实时定量pcr溶解曲线；图6是本发明实施例2中的扩增曲线；图7是本发明实施例3中的肉鸡肠道肠球菌绝对定量pcr标准曲线；图8是本发明实施例3中的肠球菌质粒标准品实时定量pcr溶解曲线；图9是本发明实施例3中的扩增曲线。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1肉鸡肠道乳杆菌的定量检测方法该方法包括以下步骤：步骤1、dna提取：采用粪便基因组提取试剂盒，将肉鸡盲肠内容物总dna提取于1.5mlep管中，测其核酸浓度，灭菌超纯水稀释到20ng/μl，与原液一起保存于-20℃冰箱，待用；步骤2、引物合成：合成肉鸡肠道乳杆菌pcr引物，其上游引物为cgatgagtgctaggtgttgga，核苷酸序列如seqidno.1所示；下游引物为caagatgtcaagacctggtaag，序列如seqidno.2所示；步骤3、构建质粒：1)以肉鸡肠道内容物总dna为模板，用步骤2中的引物进行pcr扩增，按照表1的pcr反应体系扩增产物，琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶dna小量回收试剂盒(magen,d2111-02)回收纯化目的片段，测od值，-20℃保存。2)用试剂盒pmdtm19-tvectorcloningkit(takara，6013)将1)中纯化的目的片段连结在载体上并转化，按照说明书制备10μl连接混合液，16℃，30min；1μl混合液加入10μldh5α冰上30min，可做一个重复组；42℃热激90s，冰上3min；500μl的lb培养基，37℃，复苏45-60min，220rpm/min；4000rpm/min离心，2min，弃400μl，重悬，la平板上涂板，37℃过夜培养，不超过16h。3)挑取单菌落白斑，于10ul液体la培养基中，取1ul进行菌落pcr，剩下的加500ul的液体la培养基。pcr结果阳性的菌液测序。4)测序结果在blast上比对，阳性结果菌液发酵后试剂盒提取质粒(20ml体积菌液回收一管)。5)质粒测序，ncbi上blast比对结果，挑选与目的菌株匹配的质粒，检测dna浓度，保存于-20℃冰箱，备用，肉鸡肠道乳杆菌质粒如基因序列seqidno.3所示。步骤4、标准品的制作：将质粒按十倍稀释法，用灭菌超纯水稀释成10-1-10-9的浓度梯度，取9个无菌的1.5mlep管，根据浓度由大到小依次编号1-9，并各加入90μl灭菌的超纯水，取乳杆菌标准质粒原液10μl于试管中，快速轻柔吹打20-30次，重复该步骤至9号ep管，得到包括原液的10个梯度的标准品；步骤5、样品检测：选取3-7号标准品与样品稀释液一起按照表1的反应体系以及表2的反应条件进行荧光定量pcr反应。试验所用设备为bio-rad96孔荧光定量pcr仪。表1pcr反应体系试剂体积上游引物0.8μl下游引物0.8μlrnase-freeddh2o7.4μlsybrgreensupermix10μldna模板1μltotal20μl表2pcr反应条件本实施例1成功建立肉鸡肠道乳杆菌绝对定量pcr标准曲线，见图1。本实施例1通过对肉鸡肠道乳杆菌的绝对定量，可以确定该菌的绝对拷贝数，对其微生物水平分析提供参考依据。以初始模板量的对数为横坐标，ct值为纵坐标，绘制出乳杆菌的荧光定量pcr标准曲线，初始模板浓度与ct值之间呈较好的线性关系，相关系数为1.000，斜率为-3.553，扩增效率为91.2％。通过乳杆菌质粒标准品实时定量pcr溶解曲线(见图2)的检测，可见为单峰，因此本发明扩增产物特异性好。扩增曲线(见图3)显示，检测样品ct值在标准品ct值范围内，得出的拷贝数准确性高。实施例2肉鸡肠道总菌数的定量检测方法该方法所用到的pcr引物包括上游引物和下游引物，其中，上游引物为cggcaacgacgcaaccc，核苷酸序列如seqidno.4所示；下游引物为ccattgtagcacgtgtgtagcc，核苷酸序列如seqidno.5所示；荧光定量pcr反应的退火温度为60℃；制备得到的肉鸡肠道总菌质粒序列如seqidno.6所示，其余步骤同实施例1。本实施例2成功建立肉鸡肠道总菌绝对定量pcr标准曲线，见图4。本实施例2通过对肉鸡肠道总菌的绝对定量，可以确定总菌的绝对拷贝数，对其微生物水平分析提供参考依据。以初始模板量的对数为横坐标，ct值为纵坐标，绘制出总菌的荧光定量pcr标准曲线，初始模板浓度与ct值之间呈较好的线性关系，相关系数为0.996，斜率为-3.456，扩增效率为94.7％。通过总菌质粒标准品实时定量pcr溶解曲线(见图5)的检测，可见为单峰，因此本发明扩增产物特异性好。扩增曲线(见图6)显示，检测样品ct值在标准品ct值范围内，得出的拷贝数准确性高。实施例3肉鸡肠道大肠杆菌数的定量检测方法该方法所用到的pcr引物包括上游引物和下游引物，其中，上游引物为gttaatacctttgctcattga，核苷酸序列如seqidno.7所示；下游引物为accagggtatctaatcctgtt，核苷酸序列如seqidno.8所示；荧光定量pcr反应的退火温度为50℃；制备得到的肉鸡肠道大肠杆菌质粒序列如seqidno.9所示，其余步骤同实施例1。本实施例3成功建立肉鸡肠道大肠杆菌绝对定量pcr标准曲线，见图7。本实施例3通过对肉鸡肠道大肠杆菌的绝对定量，可以确定大肠杆菌的绝对拷贝数，对其微生物水平分析提供参考依据。以初始模板量的对数为横坐标，ct值为纵坐标，绘制出大肠杆菌的荧光定量pcr标准曲线，初始模板浓度与ct值之间呈较好的线性关系，相关系数为0.999，斜率为-3.907，扩增效率为80.3％。通过大肠杆菌质粒标准品实时定量pcr溶解曲线(见图8)的检测，可见为单峰，因此本发明扩增产物特异性好。扩增曲线(见图9)显示，检测样品ct值在标准品ct值范围内，得出的拷贝数准确性高。本发明可用于其他动物肠道微生物的检测。上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。sequencelisting<110>广东省农业科学院动物科学研究所<120>一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法<130>2017<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1cgatgagtgctaggtgttgga21<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2caagatgtcaagacctggtaag22<210>3<211>1091<212>dna<213>肉鸡肠道乳杆菌质粒<400>3aaagttccatggcctcattcggtggtaagttcttagcatcgggcggatgtaggagcaaac60cattaggacatggtcacgacgacggtcacgctattcagcccaaatggcccacctgagttc120tgctatcaatggcctattccgcgtcgccagcccgacttgccccccaagcacgtgtgtcgg180gtcgaacctcgcttgctggatgtggcttgactctatggatgtcgcactcgatactctttc240gcggtgcgaagggcttccctctttccgcctgtccataggccattcgccgtcccagccttg300tcctctcgcgtgctccctcgaaggtccccctttgcggaccatagaaatatcaggacagcc360caaagcggtggagactgaactcgcagctaaaaacactacgagcagtccccccgcctcgga420tacctttttgcggtcgttgcgccggaaaaatgccaaggaccggaaaacgaccggaaaacg480agtgtacaagaaaggacgcaataggggactaagacacctattggcataatggcggaaact540cactcgactatggcgagcggcgtcggcttgctggctcgcgtcgctcagtcactcgctcct600tcgccttctcgcgggttatgcgtttggcggagaggggcgcgcaaccggctaagtaattac660gtcgaccgtgctgtccaaagggctgacctttcgcccgtcactcgcgttgcgttaattaca720ctcaatcgagtgagtaatccgtggggtccgaaatgtgaaatacgaaggccgagcatacaa780cacaccttaacactcgcctattgttaaagtgtgtcctttgtcgatactggtactaatgcg840gttcgaacgtacggacgtccagctgctaagttctacagttctggaccattccaagaagcg900caacgaagcttaatttggtgtatgaggtgacgaacacgcccgggggcagttaaggaaact960caaagttggaacgccagcatgaggggtccacctaatgaataacacaattgacgccgtgac1020ttccccagttaggaggttgtggatcgtgagtagcttagagatctcctaggggcccatggc1080tcgagcttaag1091<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列<400>4cggcaacgacgcaaccc17<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5ccattgtagcacgtgtgtagcc22<210>6<211>1094<212>dna<213>肉鸡肠道总菌质粒<400>6ccaagtgtctccggtctaggtttatgcaaaaaaatccatcggcatcatccggtggtaagt60tctgaagcatcgtggcggatgtatggagcgaaaccattaggacaatggtcaccgacgacg120gtcaccgctattcagcacagaatggcccaacctgagttctgctatcaatggcctattccg180cgtcgccagcccgacttgccccccaagcacgtgtgtcgggtcgaacctcgcttgctggat240gtggcttgactctatggatgtcgcactcgatactctttcgcggtgcgaagggcttccctc300tttccgcctgtccataggccattcgccgtcccagccttgtcctctcgcgtgctccctcga360aggtccccctttgcggaccatagaaatatcaggacagcccaaagcggtggagactgaact420cgcagctaaaaacactacgagcagtccccccgcctcggatacctttttgcggtcgttgcg480ccggaaaaatgccaaggaccggaaaacgaccggaaaacgagtgtacaagaaaggacgcaa540taggggactaagacacctattggcataatggcggaaactcactcgactatggcgagcggc600gtcggcttgctggctcgcgtcgctcagtcactcgctccttcgccttctcgcgggttatgc660gtttggcggagaggggcgcgcaaccggctaagtaattacgtcgaccgtgctgtccaaagg720gctgacctttcgcccgtcactcgcgttgcgttaattacactcaatcgagtgagtaatccg780tggggtccgaaatgtgaaatacgaaggccgagcatacaacacaccttaacactcgcctat840tgttaaagtgtgtcctttgtcgatactggtactaatgcggttcgaacgtacggacgtcca900gctgctaaggtaacatcgtgcacacatcgggttctgtattccccgtactactaaactgca960gtaggggtggaaggaggcacaataggtgccgtcagagaggtctcacgggttgatttacta1020ccgatgacttctattcccaacgcagcaacggcttagagatctcctaggggcccatggctc1080gagcttagtgatgg1094<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7gttaatacctttgctcattga21<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<400>8accagggtatctaatcctgtt21<210>9<211>1094<212>dna<213>大肠杆菌质粒<400>9ccccaagcagtggttggggtcgaacctcccttgctgaagggggctttaccctagggaggt60cgcactcgaaaccctttcgcggtgcgaagggcttccctctttccgcctgtccaaaggcca120ttcgccgtcccagccttgtcctctcgcgtgctccctcgaaggtccccctttgcggaccat180agaaatatcaggacagcccaaagcggtggagactgaactcgcagctaaaaacactacgag240cagtccccccgcctcggatacctttttgcggtcgttgcgccggaaaaatgccaaggaccg300gaaaacgaccggaaaacgagtgtacaagaaaggacgcaataggggactaagacacctatt360ggcataatggcggaaactcactcgactatggcgagcggcgtcggcttgctggctcgcgtc420gctcagtcactcgctccttcgccttctcgcgggttatgcgtttggcggagaggggcgcgc480aaccggctaagtaattacgtcgaccgtgctgtccaaagggctgacctttcgcccgtcact540cgcgttgcgttaattacactcaatcgagtgagtaatccgtggggtccgaaatgtgaaata600cgaaggccgagcatacaacacaccttaacactcgcctattgttaaagtgtgtcctttgtc660gatactggtactaatgcggttcgaacgtacggacgtccagctgctaacaattatggaaac720gagtaactgcaatgggcgtcttcttcgtggccgattgaggcacggtcgtcggcgccatta780tgcctcccacgttcgcaattagccttaatgacccgcatttcgcgtgcgtccgccaaacaa840ttcagtctacactttaggggcccgagttggacccttgacgtagactatgaccgttcgaac900tcagagcatctccccccatcttaaggtccacatcgccactttacgcatctctagacctcc960ttatggccaccgcttccgccgggggacctgcttctgactgcgagtccacgctttcgcgcc1020cctcgtttgtcctaatctatgggaccattagagatctcctaaggggcccatggctcgagc1080ttagtgaccggagc1094当前第1页12