饮用水源水中肠道病毒的检测方法
【专利摘要】一种饮用水源水中肠道病毒的检测方法，属于水质检测方法领域。该检测方法，包括以下步骤：（1）水样处理，（2）水样浓缩，（3）细胞培养，（4）病毒检测。本发明所述的检测方法测定水中肠道病毒含量简单易行、准确度高、重复性高、检测极限低，可在环境监测站作为水中肠道病毒含量的测定方法而推广使用。
【专利说明】饮用水源水中肠道病毒的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种饮用水源水中肠道病毒的检测方法，属于水质检测方法领域。
【背景技术】
[0002]随着生活水平的日益改善，人们对生活饮用水的卫生要求不断提高。由水传播的病毒性疾病的流行在许多国家和地区都有报告。为确保饮用水的质量，对水源水和饮用水中肠道病毒的检测具有重要的现实意义。
[0003]因此，研究一种准确度高、重复性高、操作简便、检测极限低的饮用水源水中肠道病毒的检测方法很有必要。
【发明内容】
[0004]本发明旨在提供一种准确度高、重复性高、操作简便、检测极限低的饮用水源水中肠道病毒的检测方法。
[0005]本发明所述的饮用水源水中肠道病毒的检测方法，包括以下步骤:
(I)水样处理:用无菌采样瓶收集水源水样,将1%体积比的Earl^ s平衡液加入水样中以促进病毒的吸附，充分混匀，用lmol/L盐酸调pH为4.5。
[0006](2)水样浓缩:将一张直径175mm的滤纸平铺于175mm直径的过滤器网板上，用无菌水浸湿，将滑石粉-硅藻土混悬液倒在浸湿的滤纸上，加压抽滤，使之形成均匀而平整的薄层，然后盖上两张直径相同的滤纸。将处理好的水样加到吸附层上加压过滤。待水样全部通过吸附层后，用30mL的3%牛肉浸膏洗脱液洗脱吸附层上的病毒，抽滤，收集洗脱液。用lmol/L盐酸调pH至7.2左右。用0.22 μ m的微孔滤膜抽滤除菌，得到水样浓缩液，置4°C冰箱待用。
[0007](3)细胞培养:将长成单层的Hela细胞生长液倒掉，加入适量的EDTA-胰酶消化液消化，加入适量的生长液，用吸管吹打分散细胞，再用生长液稀释并分装于细胞培养瓶中，37°C培养。
[0008](4)病毒检测:细胞成片后，弃去生长液，加水样浓缩液，37°C吸附1-2小时，每隔15分钟振荡一次；将接种过的细胞倒掉水样液，加适量的46°C _47°C营养琼脂平铺待凝，凝固后37°C翻转培养48小时，然后用甲醛液固定20分钟，甩掉琼脂，自来水冲洗干净，再加入结晶紫染色20分钟，自来水冲洗，观察空斑并计数，设一瓶空白对照，即细胞不经接种做空斑试验；通过空斑数量计算病毒浓度。
[0009]优选的，本发明所述的Earle' s平衡盐液配制方法为A液:取氯化钠6.Sg、氯化钾0.4g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钠0.125g、葡萄糖lg、碳酸氢钠Ig溶于800mL 二次蒸馏水中，B液:氯化钙0.2g溶于150mL 二次蒸馏水中，使用时将B液加到A液中搅拌均匀，4°C保存。
[0010]更优选的，本发明所述的滑石粉-硅藻土混悬液配制方法为取滑石粉2.7g、硅藻土 0.9g加入10mL 二次蒸馏水中混匀后室温或4°C保存。
[0011]进一步优选的，本发明所述的生长液配制方法为取浓度为1.04%的1640培养液90mL、小牛血清(灭活)10mL、双抗液ImL混匀后4°C保存。
[0012]更进一步优选的，本发明所述的EDTA-胰酶消化液配制方法为取胰蛋白酶2.5g、EDTA 0.3g、氯化钠8.0g、氯化钾0.4g、葡萄糖1.0g、碳酸氢钠0.5g,0.22 μ m微孔滤膜抽滤除菌，-20°C保存。
[0013]本发明所述的检测方法中，分为水样浓缩、细胞培养、病毒检测三部分。水中病毒浓缩方法有很多种，鉴于有的需昂贵的仪器设备，有的操作繁琐。本方法采用了适合于一般实验室条件下开展水病毒检测的滑石粉-硅藻土浓缩系统，其基本原理是病毒与滑石粉发生电化学作用产生一种可逆性结合，在酸性环境中病毒带正电荷，易吸附在滑石粉上；在碱性环境中，用洗脱液能有效地将吸附于滑石粉上的病毒洗脱下来，病毒不能独立繁殖，必须寄生于细胞内才能增殖。由于病毒在敏感细胞中可使细胞产生病变，并在一定条件下形成蚀斑，所以将待检水样接种于敏感细胞中，根据细胞病变效应(CPE)可定性判断病毒的有无；根据空斑形成单位(PFL)来定量计算水中病毒的含量。
[0014]水中肠道病毒含量的计算公式为 E= ((A/B) XC) /D
其中，E—水中病毒浓度，单位；PFL/L ；A—每瓶空斑数，单位:个PFL;B—接种量，单位:mL ；C—水样浓缩量，单位:mL ；D—水样米集量，单位:L
本发明所述的检测方法中，分为水样浓缩、细胞培养、病毒检测三部分，测定水中肠道病毒含量简单易行、准确度高、重复性高、检测极限低，可在环境监测站作为水中肠道病毒含量的测定方法而推广使用。
【具体实施方式】
[0015]实施例一:
配制Earle' s平衡盐液:A液:取氯化钠6.8g、氯化钾0.4g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钠
0.125g、葡萄糖lg、碳酸氢钠Ig溶于800mL 二次蒸懼水中,B液:氯化I丐0.2g溶于150mL 二次蒸馏水中，使用时将B液加到A液中搅拌均匀，40C保存。
[0016]配制滑石粉-硅藻土混悬液:取滑石粉2.7g、硅藻土 0.9g加入10mL 二次蒸馏水中混勾后室温或4 C保存。
[0017]配制生长液:取浓度为1.04%的1640培养液90mL、小牛血清(灭活)10mL、双抗液ImL混匀后4°C保存。
[0018]配制EDTA-胰酶消化液:取胰蛋白酶2.5g、EDTA 0.3g、氯化钠8.0g、氯化钾0.4g、葡萄糖1.0g、碳酸氢钠0.5g,0.22 μ m微孔滤膜抽滤除菌，-20°C保存。
[0019]水样处理:用无菌采样瓶收集水源水样，将1%体积比的Earle' s平衡液加入水样中以促进病毒的吸附，充分混匀，用lmol/L盐酸调pH为4.5。
[0020]水样浓缩:将一张直径175mm的滤纸平铺于175mm直径的过滤器网板上，用无菌水浸湿，将滑石粉-硅藻土混悬液倒在浸湿的滤纸上，加压抽滤，使之形成均匀而平整的薄层，然后盖上两张直径相同的滤纸。将处理好的水样加到吸附层上加压过滤。待水样全部通过吸附层后，用30mL的3%牛肉浸膏洗脱液洗脱吸附层上的病毒，抽滤，收集洗脱液。用lmol/L盐酸调pH至7.2左右。用0.22 μ m的微孔滤膜抽滤除菌，得到水样浓缩液，置4°C冰箱待用。
[0021]细胞培养:将长成单层的Hela细胞生长液倒掉，加入适量的EDTA-胰酶消化液消化，加入适量的生长液，用吸管吹打分散细胞，再用生长液稀释并分装于细胞培养瓶中，37°C培养。
[0022]病毒检测:细胞成片后，弃去生长液，加水样浓缩液，37°C吸附1-2小时，每隔15分钟振荡一次；将接种过的细胞倒掉水样液，加适量的46°C _47°C营养琼脂平铺待凝，凝固后37°C翻转培养48小时，然后用甲醛液固定20分钟，甩掉琼脂，自来水冲洗干净，再加入结晶紫染色20分钟，自来水冲洗，观察空斑并计数，设一瓶空白对照，即细胞不经接种做空斑试验；通过空斑数量计算病毒浓度。
[0023]水中肠道病毒含量的计算公式为 E= ((A/B) XC) /D
其中，E—水中病毒浓度，单位；PFL/L ；A—每瓶空斑数，单位:个PFL;B—接种量，单位:mL ；C—水样浓缩量，单位:mL ；D—水样米集量，单位:L。
【权利要求】
1.饮用水源水中肠道病毒的检测方法，包括以下步骤: (1)水样处理:用无菌采样瓶收集水源水样,将1%体积比的Earl^s平衡液加入水样中以促进病毒的吸附，充分混匀，用lmol/L盐酸调pH为4.5 ; (2)水样浓缩:将一张直径175mm的滤纸平铺于175mm直径的过滤器网板上，用无菌水浸湿，将滑石粉-硅藻土混悬液倒在浸湿的滤纸上，加压抽滤，使之形成均匀而平整的薄层，然后盖上两张直径相同的滤纸，将处理好的水样加到吸附层上加压过滤，待水样全部通过吸附层后，用30mL的3%牛肉浸膏洗脱液洗脱吸附层上的病毒，抽滤，收集洗脱液，用lmol/L盐酸调pH至7.2左右，用0.22 μ m的微孔滤膜抽滤除菌，得到水样浓缩液，置4°C冰箱待用； (3)细胞培养:将长成单层的Hela细胞生长液倒掉，加入适量的EDTA-胰酶消化液消化，加入适量的生长液，用吸管吹打分散细胞，再用生长液稀释并分装于细胞培养瓶中，37°C培养； (4)病毒检测:细胞成片后，弃去生长液，加水样浓缩液，37°C吸附1-2小时，每隔15分钟振荡一次；将接种过的细胞倒掉水样液，加适量的46°C _47°C营养琼脂平铺待凝，凝固后37°C翻转培养48小时，然后用甲醛液固定20分钟，甩掉琼脂，自来水冲洗干净，再加入结晶紫染色20分钟，自来水冲洗，观察空斑并计数，设一瓶空白对照，即细胞不经接种做空斑试验；通过空斑数量计算病毒浓度。
2.如权利要求1所述的饮用水源水中肠道病毒的检测方法，其特征在于所述的Earle' s平衡盐液配制方法为A液:取氯化钠6.8g、氯化钾0.4g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钠0.125g、葡萄糖lg、碳酸氢钠Ig溶于800mL 二次蒸懼水中,B液:氯化I丐0.2g溶于150mL二次蒸馏水中，使用时将B液加到A液中搅拌均匀，40C保存。
3.如权利要求1所述的饮用水源水中肠道病毒的检测方法，其特征在于所述的滑石粉-硅藻土混悬液配制方法为取滑石粉2.7g、硅藻土 0.9g加入10mL 二次蒸馏水中混匀后室温或4°C保存。
4.如权利要求1所述的饮用水源水中肠道病毒的检测方法，其特征在于所述的生长液配制方法为取浓度为1.04%的1640培养液90mL、小牛血清(灭活)10mL、双抗液ImL混匀后4 C保存。
5.如权利要求1所述的饮用水源水中肠道病毒的检测方法，其特征在于所述的EDTA-胰酶消化液配制方法为取胰蛋白酶2.5g、EDTA 0.3g、氯化钠8.0g、氯化钾0.4g、葡萄糖1.0g、碳酸氢钠0.5g,0.22 μ m微孔滤膜抽滤除菌，_20°C保存。
【文档编号】C12Q1/70GK104372107SQ201410496524
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年9月25日 优先权日:2014年9月25日
【发明者】陆强 申请人:陕西华陆化工环保有限公司