专利名称：：军团菌选择性分离培养基的制作方法
技术领域：
：这种发明涉及一种培养基，具体是一种适合对环境和临床标本中军团菌的分离培养，可减少杂菌污染、提高军团菌分离培养阳性率的军团菌选择性分离培养基。
背景技术：
：目前，国内外公认的军团菌分离培养基是法国生物梅里埃(bioM6rieux)、英国OXOID、美国BD、DIFCO公司等生产的BCYEot-CCVC、BCYEa-GVPC和BCYEa-GPVA等[1，这些培养基大多价格昂贵(1825元/1个平皿)，在医院临床和卫生防疫部门大量应用时，检测成本高。且对军团菌分离培养阳性率由一般为35.1%—5.0%[2.3],阳性率比较低。因此现有的军团菌分离培养基不利于临床和卫生防疫部门推广应用。
发明内容本发明的目的是针对以上所述军团菌分离培养基存在的不足，提供一种成本低、分离培养阳性率偏高的军团菌选择性分离培养基。本发明是这样实现的军团菌选择性分离培养基，其包括的组份重量份数如下基础液:^母粉琼脂碳粉ACESa-酮戊二酸焦磷酸铁蛋白液L-半胱氨酸白蛋白8~1310151.5~2.58130.5~1.50.150,302.5~3.50.30.80.05~0.15染料液溴甲酚紫溴酚兰0.005~0.020.0050.02抗生素液万古霉素多粘菌素B放线菌酮0.006~0.0100.006^0.0100細5~0.002制备步骤如下(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水9001000份，用KOH将pH值调至6.85;煮沸1分钟，然后再12rC高温灭菌15分钟;将焦磷酸铁溶于8~12份水中，过滤灭菌；将12rC高温灭菌后的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷却至55'C后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；(2)将甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入2731份水进行溶解；(3)、将溴甲酚紫和溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入812份乙醇中进行溶解；(4)将万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入0.81.2份水中进行溶解；(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。本发明在包括以酵母粉、活性炭、琼脂、ACES(N-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸)缓冲剂、a-酮戊二酸、可溶性焦磷酸铁以及L-半胱氨酸等军团菌生长所必需的营养成分的基础配方上，添加染料溴麝香草酚兰和溴甲酚紫，在对军团菌进行选择性分离培养的同时可以使菌落显色，根据菌落形态和颜色鉴定和区分军团菌目标菌；添加选择性抗生素可抑制非军团菌属细菌如革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌和霉菌类生长，从而提高军团菌分离培养阳性率。与现有技术相比，本发明军团菌选择性分离培养基有益效果是(l)添加的染料使军团菌生长过程中产生色素，根据菌落形态和颜色有利于鉴定和区分军团菌目标菌；(2)添加和调整选择性抗生素浓度，提高对非军团菌属及杂菌类的抑制能力，降低对军团菌种的抑制性，从而提高了对军团菌属分离培养阳性率；(3)降低检测成本、经济实用，便于临床和卫生防疫部门推广应用。图l是空白培养基的图。图2是四区划线法接种军团菌ATCC33153标准菌株，培养72小时后的图片。具体实施例方式以下结合实施例对本发明的具体实施例进行详细的说明。实施例l军团菌选择性分离培养基，其包括的组份重量份数如下基础液酵母粉琼脂碳粉ACESa-酮戊二酸焦磷酸铁蛋白液甘氨酸L-半胱氨酸白蛋白染料液溴甲酚紫溴酚兰抗生素液9~1112~141.5~2.39~110.8~1.20.22-0.272.8~3.20.4~0.60.08~0.120.008^0.0120.008~0.012万古霉素0.0008~0.0012多粘菌素B0.007~0.009放线菌酮0.007M).009制备步骤如下(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水930980份，用KOH将pH值调至6.85;煮沸1分钟，然后再121'C高温灭菌15分钟；将焦磷酸铁溶于911份水中，过滤灭菌；将。rC高温灭菌后的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷却至55-C后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；(2)将甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入2830份水进行溶解；(3)、将溴甲酚紫和溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入9ll份乙醇中进行溶解；(4)将万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入0.91.1份水中进行溶解；(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。实施例2军团菌选择性分离培养基(BCYEa+DGVPC)，包括的组份重量份数如下:基础液酵母粉10琼脂13碳粉2.0ACES10a-酮戊二酸1.0焦磷酸铁0.25蛋白液甘氨酸3.0L-半胱氨酸0.5白蛋白0.1染料液溴甲酚紫0.01溴酚兰0.01抗生素液万古霉素0.001多粘菌素B0.008放线菌酮0.008制备步骤如下(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水950份的水，用KOH将pH值调至6.85;煮沸l分钟，然后再12rC高压灭菌(15磅)15分钟；将焦磷酸铁溶于10份水中，过滤灭菌；将高压灭菌后的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸，冷却至55'C后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；(2)、将甘氨酸、L-半胱氨酸、白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入29份的水进行溶解；(3)、将溴甲酚紫、溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入10份的乙醇中进行溶解；(4)将万古霉素、多粘菌素B、放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入1份水中进行溶解；(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。实施例3军团菌选择性分离培养基，其包括的组份重量份数如下基础液酵母粉8琼脂10碳粉1.5ACES8a-酮戊二酸0.5焦磷酸铁0.15蛋白液甘氨酸2.5L-半胱氨酸0.3白蛋白0.05染料液溴甲酚紫0.005溴酚兰0.005抗生素液万古霉素0.0005多粘菌素B0.006放线菌酮0,006制备步骤如下(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水卯0份，用KOH将pH值调至6.85;煮沸1分钟，然后再12rC高温灭菌15分钟；将焦磷酸铁溶于8份水中，过滤灭菌；将12rC高温灭菌后的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷却至55。C后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；(2)将甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入27份水进行溶解；(3)、将溴甲酚紫和溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入8份乙醇中进行溶解；(4)将万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入0.8份水中进行溶解；(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。实施例4军团菌选择性分离培养基，其包括的组份重量份数如下:基础液酵母粉13琼脂15碳粉2.5ACES13a-酮戊二酸1.5焦磷酸铁0.30蛋白液甘氨酸3.5L-半胱氨酸0.8白蛋白0.15染料液溴甲酚紫0.02溴酚兰0.02抗生素液万古霉素0.002多粘菌素B0.010放线菌酮0.010制备步骤如下(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水1000份，用KOH将pH值调至6.85;煮沸l分钟，然后再12rC高温灭菌15分钟；将焦磷酸铁溶于12份水中，过滤灭菌；将12rC高温灭菌后的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷却至55'C后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；(2)将甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入31份水进行溶解(3)、将溴甲酚紫和溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入12份乙醇中进行溶解；(4)将万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入1.2份水中进行溶解；(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。本发明在军团菌选择性基础培养基的配方体系中，添加溴麝香草酚兰和溴甲酚紫燃料液和选择性抗生素。溴麝香草酚兰和溴甲酚紫在对军团菌进行选择性分离培养的同时可以使菌落显色，根据菌落形态和颜色鉴定和区分军团菌目标菌。选择性抗生素可抑制非军团菌属细菌如革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌和霉菌类生长，从而提高军团菌分离培养阳性率。其中甘氨酸(glycine)对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为1280ng/ml和160^ig/ml;对痢疾杆菌的最低抑菌浓度为640吗/ml;对伤寒杆菌的最低抑菌浓度为128(Hig/ml和640ng/ml;对大肠杆菌的最低抑菌浓度为1280ng/ml;万古霉素(vancomycin)对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用；多粘菌素B(polymixhiB)对绿脓杆菌和其他革兰阴性杆菌有明显抑制作用；放线菌酮(Cycloheximide)对霉菌类有明显抑制作用。临床检测试验将检测军团菌标本经过处理后，接种在本发明培养基中，于36°C,5。/。C02孵箱中，培养23天，一般情况下军团菌的生长明显，如图l和图2所示，图2可以明显看到军团菌的生长情况；也可能培养至l周方可观察到军团菌。该选择性培养基的特点是进行选择性分离培养的同时，可以使菌落显色，根据菌落形态和颜色鉴定和区分军团菌目标菌；此外，调整了抗生素浓度，增强了对其它非军团菌属的抑制能力，降低对军团菌种的抑制性，从而提高了对军团菌属细菌分离培养的阳性率。通过本发明对本地区釆集的206份环境水样进行军团菌分离并和一些常用的培养基进行对比试验，如下表所示，军团菌分离培养阳性率由35.1%~65.0%[2'31提高到50%~80%，并且降低成本3-5倍(3~556/1个平皿)。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本发明的培养基一方面，既可以当作普通BCYEci-基础培养基使用，防止培养过程中，其他细菌的污染；另一方面，利于通过菌落形态和颜色鉴定军团菌，可以抑制杂菌生长，大大提高军团菌分离培养检出阳性率。权利要求1、军团菌选择性分离培养基，其特征在于其包括的组份重量份数如下基础液酵母粉8～13琼脂10～15碳粉1.5～2.5ACES8～13a-酮戊二酸0.5～1.5焦磷酸铁0.15～0.30蛋白液甘氨酸2.5～3.5L-半胱氨酸0.3～0.8白蛋白0.05～0.15染料液溴甲酚紫0.005～0.02溴酚兰0.005～0.02抗生素液万古霉素0.0005～0.002多粘菌素B0.006～0.010放线菌酮0.006～0.010制备步骤如下(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水900～1000份，用KOH将pH值调至6.85；煮沸1分钟，然后再121℃高温灭菌15分钟；将焦磷酸铁溶于8～12份水中，过滤灭菌；将121℃高温灭菌后的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷却至55℃后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；(2)将甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入27～31份水进行溶解；(3)、将溴甲酚紫和溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入8～12份乙醇中进行溶解；(4)将万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入0.8～1.2份水中进行溶解；(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。2、如权利要求1所述的军团菌选择性分离培养基，其特征在于包括的组份重量份数如下基础液酵母粉琼脂碳粉ACESa-酮戊二酸焦磷酸铁蛋白液甘氨酸L-半胱氨酸白蛋白染料瓶溴甲酚紫溴酚兰抗生素液万古霉素多粘菌素B放线菌酮制备步骤如下(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水930^诉0份，用KOH将pH值调至6.85;煮沸1分钟，然后再121"C高温灭菌15分钟；将焦磷酸铁溶于911份水中，过滤灭菌；将121'C高温灭菌后的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸冷却至55'C后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；(2)将甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入2830份水进行溶解；(3)、将溴甲酚紫和溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入911份乙醇中进行溶解；(4)将万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入0.91.1份水中进行溶解；(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。3、如权利要求2所述的军团菌选择性分离培养基，其特征在于包括的组份重量份数如下基础液酵母粉10琼脂13碳粉2.0ACES10a-酮戊二酸1.0焦磷酸铁0.25蛋白液甘氨酸3.0L-半胱氨酸0.5白蛋白0.1染料液溴甲酚紫0.01溴酚兰0.01抗生素液万古霉素0.001多粘菌素B0.008放线菌酮0.008制备步骤如下(1)基础液中的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸按上述重量份数称量放置容器中，加水950份的水，用KOH将pH值调至6.85;煮沸l分钟，然后再12rC高温灭菌15分钟；将焦磷酸铁溶于10份水中，过滤灭菌；将12rC高温灭菌后的酵母粉、琼脂、碳粉、ACES和a-酮戊二酸，冷却至55'C后加入过滤灭菌的焦磷酸铁溶液混匀；(2)、将甘氨酸、L-半胱氨酸和白蛋白按上述重量份数称量放置容器中加入29份的水进行溶解；(3)、将溴甲酚紫和溴酚兰按上述重量份数称量放置容器中加入10份的乙醇中进行溶解；(4)将万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮按上述重量份数称量放置容器中加入1份水中进行溶解；(5)将(1)步骤的溶液加入(2)步骤得到的溶液中，所得到的混合液再加入(3)步骤得到的溶液中，最后将所得到的混合液加入(4)步骤所得到的溶液中混匀。全文摘要本发明公开一种军团菌选择性分离培养基，其是在军团菌BCYEα-基础培养基基础配方上添加染料溴麝香草酚兰和溴甲酚紫；又添加了军团菌选择抗生素甘氨酸、万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮。本发的有益效果是(1)添加的染料使军团菌生长过程中产生色素，根据菌落形态和颜色有利于鉴定和区分军团菌目标菌；(2)添加和调整选择性抗生素浓度，提高对非军团菌属及杂菌类的抑制能力，降低对军团菌种的抑制性，从而提高了对军团菌属分离培养阳性率；(3)降低检测成本、经济实用，便于临床和卫生防疫部门推广应用。文档编号C12N1/20GK101643713SQ20091004028公开日2010年2月10日申请日期2009年6月16日优先权日2009年6月16日发明者张远志,朱庆义,娟王,胡朝晖,詹晓勇申请人:广州金域医学检验中心有限公司