直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉的制备方法

专利名称：直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉的制备方法
技术领域：
本发明涉及乳酸菌冻干粉的制备，具体是指一种直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉 及其制备方法。
技术背景传统的商业发酵剂所含活菌量少，约为107-108个&，不能直接用于生产，需经过活化、扩增才能用于乳品生产，这种发酵剂用量大，制作过程繁杂，质量不易控制，容易污染杂 菌和噬菌体，菌种随着传代数增加而改变，导致发酵产品质量不稳定，可重复性差。直投 式乳酸菌发酵剂指不需要经过活化、扩增而直接应用于生产的一类新型发酵剂，该种发酵 剂的关键是要活菌数要高，以保证接种量少，接种后可快速复水，可在比较短的时间内完 成发酵过程。制备这种发酵剂的关键在于增菌培养条件、保护剂和真空干燥条件的选择，因为干酪 乳杆菌鼠李糖亚种在发酵过程中会产生乳酸，乳酸积累到一定程度会抑制乳酸菌自身的生长；该菌的收获时间也非常关键，微生物生长分成延迟期、对数生长期、稳定期和衰退期， 收获采用离心和冷冻干燥，离心和冷冻干燥对不同菌龄的细胞损伤不一样，因此收获的菌 龄非常重要；收获后的菌体细胞需要加入保护剂进行悬浮，菌体细胞悬浮密度对冻干后的 存活率有影响；细菌在冷冻干燥过程中非常容易受到损伤，因此需要加入合适的保护剂， 而保护剂又分成渗透性和非渗透性，只有渗透性保护剂不仅存在细胞表面，而且还可以渗 透到细胞内部，从而有效阻止细胞内外的冷冻损伤，另外保护剂的持水性对细胞的冷冻损 伤也有非常重要的影响；预冻温度、预冻时间和预冻速率对细菌细胞的存活率和复水性影 响也很大，因此在预冻过程中尽量生成小冰晶，有利于冷冻干燥后发酵剂的复水。刘冬梅等人于《华南理工大学学报(自然科学版)》2006年第五期发表的"潜在益生 菌鼠李糖乳杆菌在大豆奶酪中的稳定性"中报道了Za"o6"d〃w;ysubsp, 7'/^m"cww;y 6013 在MRS基础培养基的培养上清液对S. flww^有很好的抑菌作用。申请号为200610123898.7 的中国发明公开了 "一种即食含活益生菌的泡菜及其制备方法"，其干酪乳杆菌鼠李糖亚 种6013可用于泡菜的发酵并在24h完成发酵。刘冬梅等人于《华南理工大学学报(自然科 学版)》2008年第七期发表的"丄flcto6ac/〃w caw/ subsp. LCR719抑制泡菜中的 亚硝酸盐"中报道了该菌在泡菜发酵过程中能抑制亚硝酸盐的产生。吴晖等人于《食品工 业科技》2008年第四期发表的"鼠李糖乳杆菌发酵生产L-乳酸培养基的优化"中报道了该 菌能发酵产生L-乳酸的产量高达143.6g/L。为了使该菌能在工业上大量生产和应用，对其进行增菌培养，以获得能直接用于生产的高密度发酵剂。乳酸(Lactic acid)的学名为2-羟基丙酸，结构式为CH3CHOHCOOH，相对分子质量 为90.0S,由于分子内含有一个不对称碳原子，因此具有旋光异构现象，可区分为L-乳酸和 D-乳酸，当两者以等比例混合时，即成为内消旋的DL-乳酸。由于人体只有代谢L-乳酸的 L-乳酸脱氢酶，世界卫生组织提倡在食品及医药行业中使用L-乳酸取代目前普遍使用的 DL-乳酸，WHO明确规定，人体每天摄取D-乳酸的量限制在100mg/kg体重以下，而对L-乳酸不加限制。研究含L-乳酸的食品以替代含D-乳酸和DL-乳酸的食品具有重要意义。申请号为200710048203.8的中国发明公开了一种"高活性泡菜直投式菌剂的制备技 术"，是将植物乳杆菌、短乳杆菌、肠膜明串珠菌、酵母菌按一定的比例混合的复合菌剂。 但是没有公开菌粉中各个菌的活菌数量，没有用到干酪乳杆菌鼠李糖亚种，用于泡菜发酵 时耗时为48h,也没有涉及发酵后泡菜中亚硝酸盐的情况，同时也没有明确冻干粉的包装 方式和包装条件。专利号为200610010517.4的中国发明公开了 "直投式酸奶发酵菌剂的生产方法"，是将 嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种等菌进行分别培养，没有用到干酪乳杆菌鼠李糖亚 种，该菌剂也是复合菌剂且只用于酸奶发酵，其中的活菌数量为104-101()个&，同时也没有 明确冻干粉的包装方式和包装条件。专利号为02144963.5的中国发明专利公开了 "直投式酸奶发酵剂的制作方法"，是将嗜 热链球菌和保加利亚杆菌进行混合培养，经一系列工序制成的复合菌剂。但是没有公开菌 剂中各个菌的活菌数量，没有用到干酪乳杆菌鼠李糖亚种，该菌剂只用于酸奶发酵。用了 充氮包装，但没有明确包装过程中气流湿度和环境湿度。专利号为200410088476.1 (授权公告号CN 1285292C)的中国发明专利公开了 "一种 用于生产泡菜的直投式复合菌粉产品及其生产方法"，是复合菌剂，菌粉的活菌数量为 108~109个&，扩大培养过程中没有进行在线控制pH，所以无法实现高密度培养，该菌剂用 于泡菜发酵耗时36 50h，也没有涉及发酵后泡菜中亚硝酸盐的情况，同时也没有明确冻干 粉的包装方式。上述现有技术由于没有采用在线调控发酵pH值，并且所选择的增菌培养基、收获菌 龄、保护剂、预冻的条件和包装条件等不合适，普遍存在活菌数量不高、用于生产时发酵 时间长、复水速率差等缺点，而且没有考虑冻干粉中含有乳糖、葡萄糖等糖类，在贮存过 程中会吸潮的问题。5发明内容本发明的目的是为了解决上述现有技术存在的不足，提供一种活菌数含量为10u~1012 cfb/g、用于生产时发酵时间短、复水性好的直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉及其制备 方法。该直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉可用于发酵生产酱腌菜(含泡菜)、香肠、 酸奶、L-乳酸、玉米粉、豆粕、花生粕和用作益生菌制剂等。本发明的目的通过如下技术方案实现一种直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉的制备方法，包括如下步骤和工艺条件-第一步将干酪乳杆菌鼠李糖亚种aactotoc/〃w owe/ subsp. 7'/ww"asw;y 6013 ，简称LCR 6013)的冻干粉置于MRS (由de Man， Rogosa和Sharp在1960年发明，简称MRS)培养基 中，于28~30 。C静止培养24 h~36 h，制成母发酵剂；以重量份数计，所述MRS培养基配方 为蛋白胨0.8 1.0份，酵母抽提物0.5 0.7份，葡萄糖1.5 2.0份，柠檬酸二铵0.1 0.2份，硫 酸镁0.048 0.058份，牛肉膏0.5 1.0份，磷酸氢二钾0.1 0.2份，硫酸锰0.015 0.025份，乙酸 钠0.4 0.5份，吐温80 0.1~0.3份，蒸馏水94.0 96.0份；搅拌溶解均匀后用0.08 0.10 MPa灭 菌15~20 min，冷却至28~30 。C备用；第二步以体积比为2 5: IOO的比例，将母发酵剂接入工作发酵剂培养基中，于28~30 。C静止培养24h 36h，制成工作发酵剂；以重量份数计，所述工作发酵剂培养基配方为-蛋白胨0.8 1.0份，酵母抽提物0.5 0.7份，葡萄糖1.5 2.0份，柠檬酸二铵0.1 0.2份，硫酸镁 0.048~0.058份，牛肉膏0.5 1.0份，磷酸氢二钾0.1 0,2份，硫酸锰0.015 0.025份，乙酸钠 0.4~0.5份，吐温80 0.1~0.3份，番茄汁6.0 8.0份，胡萝卜汁4.5 6.0份，抗坏血酸0.02~0.04 份和蒸馏水79.8 85.4份；搅拌溶解均匀后用0.08 0.10 MPa灭菌15 20 min ，冷却至28~30 。C 备用；第三步以体积比为2 5: IOO的比例，将工作发酵剂接入生产培养基中，于35~37 。C 下的发酵罐中进行培养，在培养过程用NaOH溶液调整pH为6.0 6.8，搅拌转速为100 150 rpm，培养16 24h后收集，得发酵菌悬液；以重量份数计，所述生产培养基配方组成为-蛋白胨2.5 3.0份，酵母抽提物0.5 0.7份，葡萄糖1.5 2.0份，柠檬酸二铵0.1 0,2份，硫酸镁 0.048 0.058份，牛肉膏0.5 1.0份，磷酸氢二钾0.1 0.2份，硫酸锰0.015 0.025份，乙酸钠 0.4~0.5份，吐温80 0.1~0.3份，番茄汁6.0 8.0份，胡萝卜汁4.5 6.0份，抗坏血酸0.02~0.04 份，蒸馏水78.0 83.7份；搅拌溶解均匀后用0.08 0.10MPa灭菌15 20min，冷却至35 37。C 备用；第四步将发酵菌悬液于5000 8000 rpm，离心20~25 min，舍弃上清液，收集菌泥； 第五步在菌泥中，按复合保护剂溶液的生理盐水溶液与菌泥的体积比为3 5: l加入复合保护剂溶液，混合均匀为保护剂悬浮液；以重量份数计，所述的复合保护剂溶液配方 组成为海藻糖5~10份，脱脂奶粉5~10份，氯化钠0.9份，蒸馏水79.1~89.1份，溶解后 搅拌均匀，用0.08 0.10MPa灭菌15 20min，冷却至常温备用；第六步将保护剂悬浮液置于浅盘中，在于-40 °C~-65 。C下预冻0.5 h~2.0 h,使保护剂 悬浮液厚度为5 15 mm;第七步将第六步所得的保护剂悬浮液置于真空冷冻干燥机中，于冷阱温度为-40 。C -65。C，真空度为1.3 13.0Pa，干燥18 20h，得冻干粉，冻干粉水分重量含量低于3 %， 活菌数达到1011 1012 cfii/g;第八步用湿度为50~60 %的恒湿空气将冻干粉的温度恢复到常温，在湿度为50~60 % 的环境中，用气流包装机进行铝塑包装，气流分装机所用的无菌干燥空气的湿度不应高于 20 %。为进一步实现本发明目的，第三步工作发酵剂与生产培养基的体积比优选为3: 100， NaOH溶液的浓度优选为l 2mol/L， pH优选为6.8，发酵温度优选为37。C。所述第五步中海藻糖优选为10份，脱脂奶粉优选为10份，氯化钠优选为0.9份。 第一步或第二步的发酵温度优选为30 。C，培养时间优选为24 h。 第六歩的浅盘厚度为40-50 mm。 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果(1) 本发明的工作发酵剂用两种培养基依次培养，使干酪乳杆菌鼠李糖亚种尽量活 化，并处同步生长状态。(2) 本发明所用的生产培养基，采用番茄汁、胡萝卜汁和抗坏血酸能保证菌体生长 过程中所需要的生长因子，促进菌体大量生长。(3) 本发明所用的冻干保护剂为5~10%海藻糖和5~10%脱脂奶粉的生理盐水溶液， 确保了冻干粉的活菌数达到10" l(^cfu/g。所用的培养基全部为可食用的，保护剂脱脂奶 粉及海藻糖也为可食用的食品配料，急性毒理试验表明该菌种是无毒可使用的，该菌株也 是中国工业微生物菌种保藏中心保藏菌种。(4) 本发明冻干粉用于L-乳酸的生产时，于37 。C发酵96-120 h，控制其中的pH为 6.5，可使总乳酸的产量达到150g/L，其中L-乳酸的含量为9"/。以上；直接用于益生菌泡 菜(酱腌菜)的发酵生产时，发酵时间为24 30h，该菌能抑制发酵过程中亚硝酸盐的产 生，发酵终止后L-乳酸含量为92.3 %;用于发酵香肠时，在15-20 。C下发酵120-240 h， 可使发酵香肠的pH为5.2~5.8， L-乳酸相对含量为91.2%，发酵过程中可不使用亚硝酸盐； 用于发酵豆粕(花生粕)时，加入原料同等量的水，在25 37。C下发酵24 72h，可提使7发酵豆粕(花生粕)的pH为5.0 6.0，其中L-乳酸相对含量为91.5。/。，蛋白质含量可提高 5.5~10.5%，并使大分子的蛋白质降解为24kDa以下；用于发酵玉米粉时，加入原料同等 量的水，在25~37 。C下发酵24~72 h，可使发酵玉米的pH为4.0~5.0，其中L-乳酸的相对 含量为93.0%;用于发酵酸奶的生产时，于41 。C发酵4.5~5.5 h，发酵酸奶酸味纯正，浓 厚，发酵终止后其中含有91。/。以上的L-乳酸；因此可用于发酵生产L-乳酸、益生菌泡菜、 香肠、豆粕、花生粕、玉米和酸奶等，并使L-乳酸相对含量为91。/。以上。(5) 本发明制备的冻干粉活菌数高，不易结块、复水性很好。(6) 保存方便，易于用于工艺生产，减少接种、扩培环节而减少了污染，保证了产 品质量的稳定性，縮短了发酵周期，解决了生产的食品安全问题，符合规模化生产的需要。


图1为干酪乳杆菌鼠李糖亚种在基础MRS和实施例1改良MRS培养基的生长曲线； 图2为实施例4用的LCR6013冻干粉发酵生产L-乳酸和用传统方法扩培的LCR6013发酵生产L-乳酸的变化曲线；图3为实施例5中用手性柱Chirex 3126的高效液相法检测L-乳酸的含量图；图4a为实施例8对照样的乳酸球菌发酵48 h的玉米粉的L-乳酸含量高效液相色谱图；图4b为实施例8用冻干粉LCR 6013发酵48 h的玉米粉的L-乳酸高效液相色谱图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求 保护的范围并不局限于实施例表示的范围。冻干粉的制备实施例1第一步将干酪乳杆菌鼠李糖亚种(编号CICC 6013，丄arfo6a"7/z^ ca"z' subsp. Aammw^ 6013，中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址北京市朝阳区霄云路32 号，邮编100027)的冻干粉置于MRS培养基中，于30。C静止培养24h，制成母发酵剂； MRS培养基的配制蛋白胨10g，酵母抽提物5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸二铵2.0g，硫酸 镁0.58g，牛肉膏10.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.25g，乙酸钠5.0 g，吐温80 1mL,蒸 馏水944.0g，于0.08 MPa灭菌20 min，冷却至30。C备用。第二步以体积比为3: IOO的比例，将母发酵剂接入工作发酵剂培养基中，于30 。C静 止培养24h，制成工作发酵剂。工作发酵剂培养基的配制蛋白胨10g，酵母抽提物5.0g， 葡萄糖20.0g，柠檬酸二铵2.0g，硫酸镁0.58g，牛肉膏10.0g，磷酸氢二钾2.0 g,硫酸锰 0,25 g，乙酸钠5.0g，吐温80 1mL，番茄汁80mL，胡萝卜汁60mL，抗坏血酸0.4g，用蒸馏水804.0g，于0.08 MPa灭菌20 min，冷却至30 。C即得到工作发酵剂培养基。番茄汁或胡萝卜汁的制作将番茄或胡萝卜用打浆机榨汁，将搾出的汁于8000 rpm, 离心20min，收集上清液，即得到番茄汁或胡萝卜汁。第三步以体积比为2: IOO的比例，将工作发酵剂接入生产培养基中，于37 。C下的发 酵罐中进行培养，在培养过程用浓度为2 mol/L的NaOH溶液保持pH为6.8，搅拌转速为150 rpm;培养20h后收集发酵菌悬液；生产培养基的配制蛋白胨30g，酵母抽提物5.0 g，葡 萄糖20.0g，柠檬酸二铵2.0g，硫酸镁0.58g，牛肉膏10.0g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸锰0.25 g，乙酸钠5.0g，吐温80 1mL，番茄汁80mL,胡萝卜汁60mL，的抗坏血酸0.4 g，蒸馏水 790,0 g，于0.08 MPa灭菌20 min，冷却至37 。C即得到生产培养基。第四步将发酵菌悬液于8000 rpm，离心20 min，舍弃上清液，收集菌泥； 第五步在菌泥中，按复合保护剂溶液与菌泥体积比为3: l加入复合保护剂溶液，混合 均匀为保护剂悬浮液；以重量份数计，所述的复合保护剂溶液配方组成为海藻糖IO g， 脱脂奶粉10g，氯化钠0.9g，蒸馏水79.1g，溶解后搅拌均匀，用0.08 MPa灭菌20 min，冷 却至常温备用；第六步将保护剂悬浮液置于厚度为40mm浅盘中，于-65 。C下预冻0.5 h，使其在容器 壁上的厚度约为10mm;第七步将铺上菌体的浅盘置于真空冷冻干燥机中，于冷阱温度为-65。C，真空度为1.3 Pa，干燥18h，冻干粉的水分含量为2.0%，活菌数达到10"cfu/g。第八步用湿度为50 %的恒湿空气将冻干粉的温度恢复到常温，在湿度为50 %的环境 中，用气流包装机进行铝塑包装，气流分装机所用的无菌干燥空气的湿度为15%，保证了 冻干粉不吸潮。通过对干酪乳杆菌鼠李糖亚种aa"o6ac/〃^ ca e/ subsp. r/^附wwws 6013)培养条件的 深入研究，严格控制发酵剂的发酵培养条件、发酵时间、冻干保护剂和真空干燥条件，选 择两次扩大发酵培养，尽量使所有的细胞处于同步生长时期，再在改良MRS培养基中进 行扩大培养，在线控制发酵pH和严格控制收获时间，活细胞数达到1011 cfu/g，并保证了 该菌龄细胞免受离心和冷冻干燥冻干的损伤。以发酵时间对干酪乳杆菌鼠李糖亚种 aa"o6ac/〃^a^/subsp./'/7amwmw6013)活菌数的对数值作曲线如图1，从图1可以看 出，在MRS基础培养基中，20h菌数达到最高值时，活菌数仅为4.50xl()Scfu/mL，而在 优化的增菌培养基中经过较短的迟滞期后即进入对数生长期，在12h左右进入对数生长期 末期，16h菌数可达1.67xl09cfu/mL，比MRS基础培养基的提高了近4倍。与MRS基础 培养基的相比较，在改良的MRS基础培养基中生长时，pH下降较为缓慢，这说明氮源的增加可以中和生长后期菌体代谢的有机酸，从而有利于菌体繁殖。LCR6013在改良培养基 中约16h左右菌数达到最高，约为1.67xl09cfU/mL， 16 28h处于稳定期，活菌数基本保 持不变。因此，最佳菌体收获时间为16 24h之间。10% (质量)的海藻糖可使细胞存活 率达85.8%，添加15% (质量)的海藻糖可使其成活率达到91.9%，海藻糖比其它任何糖 对保护干的生物材料更有效。而选用大分子保护剂脱脂奶粉作为干燥介质，因为(1) 脱脂奶粉可以通过稳定细胞膜的组成来防止细胞损伤；(2)在冷冻干燥过程中产生多孔 结构，使得脱水更加容易；(3)脱脂奶粉本身含有蛋白质可为细胞提供一个保护层的作 用。不同MnS04浓度对菌体存活率有着较大的影响，适当的浓度可以提高菌体的存活率。 而现有的技术当中由于选择的发酵培养基不合适，没有经过两次的扩大培养后再进行发酵 生产，没有在线严格控制发酵pH，没有严格控制收获菌龄，冻干保护剂的选择比较单一， 最后得到的活菌数都普遍较低。 实施例2第一步将干酪乳杆菌鼠李糖亚种(编号CICC 6013，丄""o6""7/w m e/ subsp. Aammw^ 6013，中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址北京市朝阳区霄云路32 号，邮编100027)的冻干粉置于MRS培养基中，于28。C静止培养36h，制成母发酵剂； MRS培养基的配制蛋白胨8.0g，酵母抽提物7.0g，葡萄糖15.0g，柠檬酸二铵l.O g，硫 酸镁0.48g，牛肉膏5.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸锰0.15g，乙酸钠4.0g，吐温80 3mL,蒸 馏水960g，于0.10MPa灭菌15min，冷却至28。C备用。第二步以体积比为5: IOO的比例，将母发酵剂接入工作发酵剂培养基中，于28 。C静 止培养36h，制成工作发酵剂。工作发酵剂培养基的配制蛋白胨8.0g，酵母抽提物7.0g， 葡萄糖15.0g，柠檬酸二铵1.0g，硫酸镁0,48g，牛肉膏5.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸锰0.15 g，乙酸钠4,0g，吐温80 3mL，番茄汁60mL，胡萝卜汁45mL，抗坏血酸0,2g，蒸馏水850.0 g，于0.1MPa灭菌15min，冷却至28 。C即得到工作发酵剂培养基。番茄汁或胡萝卜汁的制作将番茄和胡萝卜用打浆机搾汁，将搾出的汁于8000 rpm， 离心20min，收集上清液，即得到番茄汁或胡萝卜汁。第三步以体积比为5: IOO的比例，将工作发酵剂接入生产培养基中，于35 。C下的发 酵罐中进行培养，在培养过程用l mol/L的NaOH溶液保持pH为6.5，搅拌转速为IOO rpm， 培养24 h后收集，为发酵菌悬液；生产培养基的配制蛋白胨25 g，酵母抽提物7.0 g，葡 萄糖15.0g，柠檬酸二铵1.0g，硫酸镁0.48g，牛肉膏5.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸锰0.15g， 乙酸钠4,0g，吐温80 3mL，番茄汁60mL，胡萝卜汁45mL，抗坏血酸0.2 g，蒸馏水835.0 g， 于O.IO MPa灭菌15 min，冷却至35 。C即得到生产培养基。第四步将发酵菌悬液于6500 rpm，离心22 min，舍弃上清液，收集菌泥；
第五步在菌泥中，按复合保护剂的溶液与菌泥体积比为5: l加入复合保护剂溶液，混 合均匀为保护剂悬浮液；复合保护剂的配制海藻糖5.0g，脱脂奶粉5.0g，氯化钠0.9g, 蒸馏水89.1g，溶解后搅拌均匀，用0.1MPa灭菌15min，冷却至常温备用；
第六步将保护剂悬浮液置于厚度为50mm浅盘中，在于-40 。C下预冻2.0 h，使其在容 器壁上的厚度为15mm;
第七步将铺上菌体的浅盘置于真空冷冻干燥机中，于冷阱温度为-40。C，真空度为13 Pa，干燥20h，冻干粉的水分含量为3.0%，活菌数达到l(^cfU/g。
第八步用湿度为60 %的恒湿空气将冻干粉的温度恢复到常温，在湿度为60 %的环境 中，用气流包装机进行铝塑包装，气流分装机所用的无菌干燥空气的湿度为20%，保证了 冻干粉不吸潮。 实施例3
第一步将干酪乳杆菌鼠李糖亚种(编号CICC 6013， ￡acto6ad〃ra c"w/ subsp, 6013，中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，地址北京市朝阳区霄云路32 号；邮编100027)的冻干粉置于MRS培养基中，于29。C静止培养30h，制成母发酵剂； MRS培养基的配制蛋白胨9.0g，酵母抽提物6.0g，葡萄糖17.5g，柠檬酸二铵1。5 g，硫 酸镁0.53g，牛肉膏7.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸锰0.20g，乙酸钠4.5 g，吐温80 2mL，蒸 馏水950.0g,于0.09MPa灭菌18min，冷却至29。C备用。
第二步以体积比为2: IOO的比例，将母发酵剂接入工作发酵剂培养基中，于29 。C静 止培养30h，制成工作发酵剂。工作发酵剂培养基的配制蛋白胨9.0g，酵母抽提物6.0g， 葡萄糖17.5g，柠檬酸二铵1.5g，硫酸镁0.53g，牛肉膏7.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸锰0.20 g，乙酸钠4.5g，吐温80 2mL，番茄汁70mL，胡萝卜汁53mL，抗坏血酸0.3g，蒸馏水828。0 g，于0.09MPa灭菌18min，冷却至29 。C即得到工作发酵剂培养基。
番茄汁或胡萝卜汁的制作将番茄和胡萝卜用打浆机搾汁，将搾出的汁于8000 rpm， 离心20min，收集上清液，即得到番茄汁或胡萝卜汁。
第三步以体积比为3.5: IOO的比例，将工作发酵剂接入生产培养基中，于36。C下的发 酵罐中进行培养，在培养过程用l mol/L的NaOH溶液保持pH为6.0,搅拌转速为120 rpm， 培养16h后收集发酵菌悬液；生产培养基的配制蛋白胨27.5g，酵母抽提物6.0g，葡萄糖 17.5 g，柠檬酸二铵1.5g，硫酸镁0.53g，牛肉膏7.5g，磷酸氢二钾L5 g，硫酸锰0.20 g, 乙酸钠4.5g，吐温80 2mL，番茄汁70 mL，胡萝卜汁55mL，抗坏血酸0.3 g，蒸馏水807,0 g， 于0.09 MPa灭菌18 min，冷却至36 。C即得到生产培养基。
11第四步将发酵菌悬液于5000 rpm，离心25 min，舍弃上清液，收集菌泥； 第五步在菌泥中，按复合保护剂溶液与菌泥体积比为4: l加入复合保护剂溶液，混合 均匀为保护剂悬浮液；复合保护剂溶液的配制海藻糖7.5g，脱脂奶粉7.5g，氯化钠0.9g， 蒸馏水84.1g，溶解后搅拌均匀，用0.09MPa灭菌18min，冷却至常温备用；
第六步将保护剂悬浮液置于厚度为45mm浅盘中，在于-50 。C下预冻l h，使其在容器 壁上的厚度为5mm;
第七步将铺上菌体的浅盘置于真空冷冻干燥机中，于冷阱温度为-50。C，真空度为7.5 Pa，干燥19h，冻干粉的水分含量为2.5 %，活菌数达到10^cfii/g。
第八步用湿度为55 %的恒湿空气将冻干粉的温度恢复到常温，在湿度为55 %的环境 中，用气流包装机进行铝塑包装，气流分装机所用的无菌干燥空气的湿度为15%，保证了 冻干粉不吸潮。
冻干粉的应用
实施例4 L-乳酸的发酵生产
将实施例l制备的冻干粉于种子培养基中，37。C培养24h，得到种子液，以5%(体 积)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，37 。C培养110h (可为108 h-120 h)，用2-4 mol/L的NaOH溶液控制pH为6.5，搅拌转速为120 rpm (可为100-150 rpm)，得到L-乳酸的产量达150 g/L，如图2所示，用手性柱Chirex3126的高效液相法检测发酵过程中 的L-乳酸的含量，分析仪器高效液相色谱仪系统，配备Waters 600泵多通道输送系统； Waters 717自动进样器；Waters 2996 PDA 二极管阵列检测器；色谱柱手性柱Chirex 3126 (D)-peiiicillami， 4.6 mm IDX250 mm L。分析条件流动相为0.002 moL/L的硫酸铜溶液 溶剂为5% (质量)的异丙醇溶液，使用前经0.45 pm滤膜过滤，超声脱气；流动相流速 为0.7mL/min;柱温30。C; 二极管阵列Waters 2996，检测波长为254nm;标准和样品溶 液用前均经过0.45 pm滤膜过滤后超声脱气；进样量为2 ^L;用Empower积分软件积分， 进行峰面积法外标定量。从图2可以看出，用高密度的LCR6013冻干粉进行L-乳酸发酵， 在发酵108小时后L-乳酸达到150 g/L，而传统方法扩培的LCR 6013在发酵130 h后才达 到86g/L。
乳酸分子内含有一个不对称碳原子，因此具有旋光异构现象，区分为L(+)-乳酸(简称 L-乳酸)和D(-)-乳酸(简称D-乳酸)。由于人体只有可代谢L-乳酸的L-乳酸脱氢酶，世界 卫生组织提倡在食品及医药行业中使用L-乳酸取代目前普遍使用的DL-乳酸。因此研究能 多发酵生产L-乳酸的工艺显得非常必要。其中种子培养基和发酵培养基配制如下
种子培养基配制葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，乙酸钠2 g/L，拧檬酸铵2 g/L，吐温80 1 mL/L， MgS04.7H20 0.2 g/L， K2HP04 2 g/L， MnS04 *H20 0.05 g/L，用蒸馏水定容至1000 mL， pH 6.5，于0.10 MPa灭菌20 min，即得到L-乳酸生
产种子培养基。
发酵培养基配制葡萄糖200g/L (或相当数量的玉米粉的酶解液)，酵母粉5g/L，蛋 白胨10 g/L(或相当数量的豆粕的酶解液)，牛肉膏15 g/L，吐温80 1 ml/L，番茄汁50 ml/L， 白菜汁50ml/L，用生产用饮用水定容至1000 mL， pH 6.5，于0.10 MPa灭菌20 min，即 得到L-乳酸生产发酵培养基配制。
番茄汁或白菜汁的制备将番茄或白菜用榨汁机榨汁，将榨出的汁于5000-8000rpm, 离心20min，收集上清液，即得到番茄汁或白菜汁。
实施例5:益生菌泡菜
选择没有烂叶的芥菜或大白菜，清洗干净后，沥干表面水分，切成一定的大小并用开 水烫漂，在无菌环境下冷却至37 °C，按菜质量百分比接入5 %的将实施例1制备的冻干粉， 轻轻搅拌均匀，用灭菌水密封，于37。C发酵120h，沥干水分进行真空包装。泡菜制作过 程中要有充足的泡渍液浸没蔬菜，使菜不得浮出液面，以满足乳酸菌厌氧生长和发酵，整 个制作过程中尽可能在洁净环境下进行。经检测，本实施例生产的益生菌泡菜的亚硝酸盐 变化情况如表1所示，不含亚硝酸盐。亚硝酸盐是一种潜在的致癌物，亚硝酸盐在适宜的 条件下，可与食品中蛋白质的分解产物胺反应，生成N-亚硝基化合物。亚硝酸盐的急性中 毒作用是导致高铁血红蛋白症，即把人体血液中携氧能力的低铁血红蛋白氧化成高铁血红 蛋白，而失去携氧能力，因而引起组织缺氧中毒，并且活体和离体试验表明有致突变和致 癌的作用。测定用LCR 6013冻干粉发酵和不加菌的传统发酵的不同发酵时间的泡菜榨出 的汁中亚硝酸盐的含量(GB/T5009.33-2003的盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐法)如表1所 示，从表1可看出，新鲜芥菜中的亚硝酸盐的含量为2.87mg/L，接种LCR6013冻干粉的 泡菜在发酵24h后降为1.35mg/L，到48 h后检测不到亚硝酸盐。而未接种的对照样中的 亚硝酸盐的含量呈现先升高，后降低的趋势，在第48 h出现亚硝酸盐的峰值45.300 mg/。 可见，添加冻干粉LCR 6013对抑制泡菜中亚硝酸盐的异常积累非常有效。用高效液相法 测定LCR60D冻干粉用于泡菜发酵过程中的L-乳酸的含量，如图3所示，图中保留时间 为9.214min的为L-乳酸，占总乳酸的含量为92.3 % (检测方法同图1的检测)。此外，本 实施例利用实施例1制备的冻干粉制作出来的泡菜制作时间短为24小时，而传统方法需 要168小时，加入LCR6013冻干粉的泡菜中，LCR 6013是优势菌群，能快速生长及快速 产酸，使得泡菜经过24h发酵即达到了发酵终点，pH为3.50，颜色好和风味好。表1 泡菜发酵过程中亚硝酸盐的变化规律
发酵时间(h)024487296120
LCR6013冻干粉发酵(mg/L)2.871.350.000.000.000.00
自然发酵(mg/L)2.872.8745.3024.5010.3010.50
实施例6:发酵香肠
将原料肉剔骨后，切碎并斩拌，以重量计，加入3.0%的蔗糖、2.0%的食盐和1.5%的 料酒，混合均匀后接种实施例2制备的冻干粉，使以重量计活菌数达107个/§，混合均匀 后灌肠，捆扎好在20。C、相对湿度为95 %的环境下进行发酵，当发酵至pH5.0时终止发 酵，放入15。C，相对湿度为80%的环境下进行后熟发酵7天，入坛腌制成各种风味。由 于活菌含量高，进行优势菌群发酵，无需添加亚硝酸盐，生产出的发酵香肠滋气味非常纯 正，颜色自然，绝不含亚硝酸盐。
实施例7 发酵豆粕和花生粕的生产
以重量计，将l:l的豆粕(还可是花生粕)与水混合，在0.10MPa灭菌20min，冷却 至37。C接入实施例2的冻干粉，使以重量计活菌数达107个/§，于30。C密闭环境下发酵 36 h，发酵结束后pH为5.0-6.0，将发酵产物进行热风气流干燥，干燥进风温度控制250 。C， 混合温度控制150。C，出料温度控制75。C。 L-乳酸的相对含量在91.5。/。，蛋白质的含量可 提高5.5%，干燥物料水分控制12%以下，使大分子的蛋白质降解为24kDa以下。由于使 用了高活菌数的冻干粉，所以大大縮短了发酵时间，提高了发酵效率并提高了蛋白质含量、 降低了蛋白质的分子量和有利于消化吸收。
实施例8 发酵玉米的生产
以重量计，将l:l玉米粉与水混合，冷却至37。C左右接入实施例3的冻干粉，使以重 量计活菌数达l(T个/g，于30。C密闭环境下发酵48h，发酵结束后pH为4.0 5.0，将发酵 产物进行热风气流干燥，干燥进风温度控制280。C，混合温度控制18(TC，出料温度控制 80 。C。如图4b所示(检测方法同图2的检测)，用冻干粉LCR6013发酵48 h的玉米粉的 L-乳酸高效液相色谱图，从图4b中可看出L-乳酸占总乳酸的含量为93.0y。，图4a为对照 样的乳酸球菌的玉米发酵的L-乳酸含量，从图4a可看出(检测方法同图2的检测)，L-乳 酸占总乳酸的含量仅为18.80%。干燥物料水分控制12%以下。
实施例9 发酵酸奶的生产
按重量计，全脂奶粉12.5%、白糖8.5%、酸奶稳定剂0.3%，用生产用饮料水定容至
14刻度，均匀混合后，预热至60 °C进行均质，冷却至41 °C，按每吨奶中接入30 g的冻干粉， 于41 °C发酵5.0 h，发酵结束后酸奶的酸度达到65 °T, L-乳酸占总乳酸的含量达到91.5%。 冻干粉用气流分装机立即进行铝塑包装。用湿度为50 %的恒湿空气将冻干粉的温度恢 复到常温，在湿度为50~60%的环境中，用气流包装机进行铝塑包装，气流分装机所用的 无菌干燥空气的湿度不应高于20%，保证了冻干粉不吸潮。根据本发明制备的冻干粉活菌 数高，不易结块、复水性很好。
权利要求
1、一种直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉的制备方法，其特征在于包括如下步骤和工艺条件第一步 将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于28～30℃静止培养24h～36h，制成母发酵剂；以重量份数计，所述MRS培养基配方为蛋白胨0.8～1.0份，酵母抽提物0.5～0.7份，葡萄糖1.5～2.0份，柠檬酸二铵0.1～0.2份，硫酸镁0.048～0.058份，牛肉膏0.5～1.0份，磷酸氢二钾0.1～0.2份，硫酸锰0.015～0.025份，乙酸钠0.4～0.5份，吐温800.1～0.3份，蒸馏水94.0～96.0份；搅拌溶解均匀后用0.08～0.10MPa灭菌15～20min，冷却至28～30℃备用；第二步 以体积比为2～5∶100的比例，将母发酵剂接入工作发酵剂培养基中，于28～30℃静止培养24h～36h，制成工作发酵剂；以重量份数计，所述工作发酵剂培养基配方为蛋白胨0.8～1.0份，酵母抽提物0.5～0.7份，葡萄糖1.5～2.0份，柠檬酸二铵0.1～0.2份，硫酸镁0.048～0.058份，牛肉膏0.5～1.0份，磷酸氢二钾0.1～0.2份，硫酸锰0.015～0.025份，乙酸钠0.4～0.5份，吐温800.1～0.3份，番茄汁6.0～8.0份，胡萝卜汁4.5～6.0份，抗坏血酸0.02～0.04份和蒸馏水79.8～85.4份；搅拌溶解均匀后用0.08～0.10MPa灭菌15～20min，冷却至28～30℃备用；第三步 以体积比为2～5∶100的比例，将工作发酵剂接入生产培养基中，于35～37℃下的发酵罐中进行培养，在培养过程用NaOH溶液调整pH为6.0～6.8，搅拌转速为100～150rpm，培养16～24h后收集，得发酵菌悬液；以重量份数计，所述生产培养基配方组成为蛋白胨2.5～3.0份，酵母抽提物0.5～0.7份，葡萄糖1.5～2.0份，柠檬酸二铵0.1～0.2份，硫酸镁0.048～0.058份，牛肉膏0.5～1.0份，磷酸氢二钾0.1～0.2份，硫酸锰0.015～0.025份，乙酸钠0.4～0.5份，吐温800.1～0.3份，番茄汁6.0～8.0份，胡萝卜汁4.5～6.0份，抗坏血酸0.02～0.04份，蒸馏水78.0～83.7份；搅拌溶解均匀后用0.08～0.10MPa灭菌15～20min，冷却至35～37℃备用；第四步 将发酵菌悬液于5000～8000rpm，离心20～25min，舍弃上清液，收集菌泥；第五步 在菌泥中，按复合保护剂溶液的生理盐水溶液与菌泥的体积比为3～5∶1加入复合保护剂溶液，混合均匀为保护剂悬浮液；以重量份数计，所述的复合保护剂溶液配方组成为海藻糖5～10份，脱脂奶粉5～10份，氯化钠0.9份，蒸馏水79.1～89.1份，溶解后搅拌均匀，用0.08～0.10MPa灭菌15～20min，冷却至常温备用；第六步 将保护剂悬浮液置于浅盘中，在于-40℃～-65℃下预冻0.5h～2.0h，使保护剂悬浮液厚度为5～15mm；第七步 将第六步所得的保护剂悬浮液置于真空冷冻干燥机中，于冷阱温度为-40℃～-65℃，真空度为1.3～13.0Pa，干燥18～20h，得冻干粉，冻干粉水分重量含量低于3％，活菌数达到1011～1012cfu/g；第八步 用湿度为50～60％的恒湿空气将冻干粉的温度恢复到常温，在湿度为50～60％的环境中，用气流包装机进行铝塑包装，气流分装机所用的无菌干燥空气的湿度不应高于20％。
2、 根据权利要求l所述的直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉的制备方法，其特征在于第三步工作发酵剂与生产培养基的体积比为3: 100。
3、 根据权利要求l所述的直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉的制备方法，其特征在 于所述第三步中NaOH溶液的浓度为l 2mol/L。
4、 根据权利要求l所述的直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉的制备方法，其特征在 于所述第三步中pH为6.8。
5、 根据权利要求l所述的直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉的制备方法，其特征在 于所述第五步中海藻糖为10份，脱脂奶粉为10份，氯化钠为0.9份。
6、 根据权利要求l所述的直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉的制备方法，其特征在 于第一步或第二步的发酵温度为30。C，培养时间为24h。
7、 根据权利要求l所述的直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉的制备方法，其特征在 于所述第三步发酵温度为37。C。
8、 根据权利要求1所述的直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉的制备方法，其特征 在于第六步的浅盘厚度为40 50mm。
全文摘要
本发明公开了一种直投式干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干粉及其制备方法。该方法将干酪乳杆菌鼠李糖亚种经过“两步法”扩大培养，尽量使细胞处于同步生长时期，然后在生产培养基中，用NaOH溶液在线控制pH为6.0～6.8，于35℃～37℃培养16h～24h，离心后收集菌泥，加入保护剂溶液，于-40℃～-65℃下预冻0.5h～2.0h，使其在容器壁上厚度为5～15mm，干燥制成直投式冻干粉。该冻干粉的活菌数达10¹¹～10¹²cfu/g，并具有复水性好、色泽好、流动性好、易于贮运、方便生产等特点。用该冻干粉可直接用于发酵生产酱腌菜、香肠、酸奶、L-乳酸、玉米粉、豆粕、花生粕和用作益生菌制剂等。
文档编号A23L1/36GK101580809SQ20091004026
公开日2009年11月18日 申请日期2009年6月16日 优先权日2009年6月16日
发明者刘冬梅, 晖 吴, 汤石生, 蕾 邢 申请人:华南理工大学