专利名称：禽白血病病毒j亚群诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于禽病毒检测诊断技术领域。
ALV-J是反转录病毒，其前病毒基因组DNA可整合到宿主细胞，与宿主细胞长期共存；而且ALV-J病毒既可水平传播，又可垂直传播。故ALV-J病毒在鸡体内引起持续性感染，鸡体产生的抗原抗体复合物，不象正常情况很快被血液中巨噬细胞和枯否细胞等构成的免疫系统清除掉，抗原抗体复合物可在血液中循环，并可在肾、肺、皮肤、关节或血管等组织中沉积，引起炎症，组织损伤。因此，检测ALV-J病毒抗原抗体复合物可以反应鸡体ALV-J的感染情况，是一种有效的诊断方法。
本发明的技术方案是应用群特异性单克隆抗体制备检测ALV-JELISA试剂盒或试纸。其制备方法为应用ALV-J特异性单克隆抗体作包被抗体制备检测ALV-J试剂盒或试纸。具体步骤为1.ALV-J病毒的分离鉴定采用鸡胚成纤维细胞分离培养，并通过免疫荧光技术鉴定。
2.用PCR方法扩增ALV-J囊膜蛋白env基因，并进行克隆。
3.用昆虫杆状病毒表达系统表达ALV-J env基因产物。
4.以重组基因产物作为免疫源免疫BALB/C小鼠，研制特异性单克隆抗体。
5.以单克隆抗体建立独特酶联免疫试验检测试剂盒或检测试纸。
6.检测试剂盒或检测试纸检测感染鸡血清、脏器及羽囊中抗原抗体复合物。
7.抗原抗体复合物阳性者判定为ALV-J感染。
本发明的效果利用该试剂盒检或检测试纸测血清、脏器、羽囊等样本中ALV-J的存在情况，其特异性强、灵敏性高、检测速度快、成本低廉。检出率达100％，比用细胞分离鉴定病毒快6-7天，与病毒分离和PCR检测结果的符合率大于90％。
具体实施例方式
方式1.1.抗ALV-J特异性单克隆抗体JE9包被96孔聚苯乙烯酶标板用0.02M pH9.6的碳酸盐缓冲液将单克隆抗体稀释为3.25ug/ml，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100ul，37℃温浴4hr；洗液(含0.05％Tween-20的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液)洗涤3遍。2.抗体包被孔聚苯乙烯酶标板的封闭用封闭液(含50mM甘氨酸的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液)于37℃下封闭1hr；洗液洗涤3遍干燥后即为反应板，置4℃或-20℃备用。3.样品处理1)血清样品1∶40稀释(稀释液为0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液，即PBS。)后直接作为加样稀释液。
2)内脏样品包括肝、脾、肾、胸腺等，处理如下取0.10g内脏于400ulPBS中碾磨后，10000rpm离心5min，取上清1∶10稀释后直接作为加样稀释液。
3)羽囊样品处理如下0.10g羽囊于400ul PBS中碾磨后，10000rpm离心5min，取上清1∶5稀释后作为加样稀释液。4.ELISA检测操作步骤1)将被待检样本加入包被有ALV-J特异性的单克隆抗体的96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100ul，每个样加2孔，并设阳性样本、正常样本和空白对照；置37℃45min后，用洗液洗涤3遍；2)每孔加酶标抗体(工作浓度)100ul；置37℃45min，用洗液洗涤5遍；3)每孔加底物显色液100ul，室温避光显色30min后，每孔加100ul的终止液；4)用酶标仪测定每孔的OD490值，OD490值超过0.20，且P/N≥2.1者判为阳性，否则为阴性。方式21.抗ALV-J特异性单克隆抗体JE9包被硝酸纤维素纸片将单克隆抗体JE9作适当稀释，直接点加硝酸纤维素纸片上；自然干燥后，洗液洗涤3遍。2.非特异性封闭将点加单克隆抗体的硝酸纤维素纸片，再以封闭液于37℃下封闭60min；洗液洗涤3遍，自然干燥后4℃保存。3.样品处理同试验方式14.检测操作步骤1)将上述硝酸纤维素纸片放入待检样本中，置37℃30min后，用洗液洗涤3遍；2)将洗涤后的硝酸纤维素纸片放入金标记抗体溶液中；置37℃30min，用洗液洗涤5遍；3)出现条带的为阳性，否则为阴性。附试剂配方1稀释液磷酸盐缓冲液PBS(pH7.2)Nacl 8gNa2HPO412H2O 2.9gKH2PO4 0.2gKcl 0.2g双蒸水1000ml2封闭液脱脂乳10gPBS(pH7.2) 100ml3洗涤液Tween-20 0.5mlPBS(pH7.2) 999.5ml4酶标抗体使用液HRP标记的兔抗鸡IgG抗体4ulPBS(pH7.2) 10ml5底物显色液0.1M的柠檬酸(C6H6O7.H2O 10.5g，双蒸水500ml) 4.86ml0.2M磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O 71.6g，双蒸水1000ml) 5.14ml邻苯二胺 4mgH2O3100ul6 2M的硫酸溶液98％浓H2SO421.7ml双蒸水 178.3ml
权利要求
1.一种禽白血病病毒J亚群诊断试剂盒，其特征在于应用群特异性单克隆抗体制备检测ALV-J ELISA试剂盒；
2.一种禽自血病病毒J亚群诊断试剂盒的制备方法，其特征在于应用ALV-J特异性单克隆抗体作包被抗体制备检测ALV-J ELISA试剂盒；
3.一种禽白血病病毒J亚群诊断试纸，其特征在于应用群特异性单克隆抗体制备检测ALV-J检测试纸；
4.一种禽白血病病毒J亚群诊断试纸的制备方法，其特征在于其特征在于应用ALV-J特异性单克隆抗体作包被抗体制备检测ALV-J检测试纸；
5.根据权利要求1或权利要求3所述禽白血病病毒J亚群诊断试剂盒或试纸的应用，其特征在于可以检测感染鸡血清、脏器及羽囊中的ALV-J抗原。
全文摘要
本发明属于禽病毒检测诊断技术领域。J亚群禽白血病病毒(ALV－J)是90年代鉴定出的一个新的禽白血病病毒亚群，是肉鸡髓细胞瘤(ML)的病原。本发明用PCR方法扩增出ALV－J囊膜蛋白env基因，并进行克隆，然后用昆虫杆状病毒表达系统表达ALV－J env基因产物，以此重组基因产物作为免疫源免疫BALB/C小鼠，研制出特异性单克隆抗体。再以单克隆抗体研制出了独特酶联免疫试验检测试剂盒，以其检测感染鸡血清、脏器及羽囊中抗原抗体复合物，判定是否感染ALV－J。
文档编号G01N33/535GK1437023SQ0311300
公开日2003年8月20日 申请日期2003年3月20日 优先权日2003年3月20日
发明者秦爱建, 叶建强, 刘岳龙, 金文杰 申请人:扬州大学