专利名称：一种检测h6n2型禽流感病毒的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用纳米金颗粒检测H6N2型禽流感病毒DNA或RNA经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术：
对基因(DNA)及其转录产物(RNA)的高灵敏性、高特异性、简单、快速的检测，对于疾病的早期诊断和治疗以及在在卫生防疫、环境监测、检验检疫等领域都具有十分重要的意义。以往在这方面较为准确灵敏的检测方法有荧光标记法、放射性标记等方法，这些方法都需要复杂的操作和特殊的设备，应用范围很窄。1993年PE公司的Dr. Kary B. Mullis发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR。随后PCR技术大规模的 应用于生物科研和临床治疗中，对DNA的检测进入了新的时代，Dr. Mullis为此还获得了1993年的诺贝尔化学奖。虽然PCR方法具有快速、灵敏、准确性高、操作较简单等优点，但由于其反应进行和产品DNA的检测需要特殊的仪器，PCR技术的使用一直被限定在专业的实验室和医院里。2001年日本荣研化学株式会社研制出了一种新型DNA扩增方式，环介导等温核酸扩增技术(LAMP)可以在恒温条件下实现DNA的高效快速扩增，该方法反应条件简单，DNA扩增效率高，因此在核酸检测方面具有明显优势。但是对LAMP扩增制备的DNA产物使用常规的检测方法，如电泳法，荧光染料法等，均无法排除LAMP扩增所带来的假阳性问题，而且需要特殊的仪器，因此限制了 LAMP技术的实际应用。禽流感，全名鸟禽类流行性感冒，是由病毒引起的动物传染病，通常只感染鸟类，少见情况会感染猪。禽流感病毒高度针对特定物种，但在罕有情况下会跨越物种障碍感染人。自从1997年在香港发现人类也会感染禽流感之后，此病症引起全世界卫生组织的高度
关注。其后，本病一直在亚洲区零星爆发，但在2003年12月开始，禽流感在东亚多国-
主要在越南、韩国、泰国——严重爆发，并造成越南多名病人丧生。直到2005年中，疫症不但未有平息的迹象，而且还不断扩散。现时远至东欧多个国家亦有案例。根据核蛋白的抗原性分类，禽流感病毒则属甲型流感病毒，甲型流感病毒是根据位于其套膜上的血凝素及神经氨酸酶的抗原性分为若干亚型，血凝素(H)有16个亚型；神经氨酸酶(N)有9个亚型。所有的这些亚型都可以感染鸟，在禽类中高致病性的属于H5、H7亚型。典型的鸡禽流感病毒是H6N2，造成1983年、1984年在美国东部大流行的是H5N2。目前东南亚地区出现的人类感染是H5N1型。1997年发现的H5N1型毒株被认定是当时流行性感冒的病源。1999年，香港出现过H9N2型禽流感的人类感染，2003年，荷兰出现过H7N7型禽流感的人类感染；2006年I月，美国出现H3N2。H6N2型禽流感病毒的对人类的生活影响很大，但是目前针对H6N2型禽流感病毒缺乏简单、快速、便于使用和成本低廉的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提出一种用纳米金颗粒检测H6N2型禽流感病毒专有的基因片段经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，从而判定H6N2型禽流感病毒的存在与否。本发明采用如下采用下述技术方案来解决上述问题本发明试剂盒包括两部分(O标记有可以识别H6N2型禽流感病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒；(2)可以扩增待检测样品中的H6N2型禽流感病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的H6N2型禽流感病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。本发明中，试剂盒的工作原理为I.纳米金颗粒标记有能识别H6N2型禽流感病毒特定序列的分子探针，分子探针被固定在纳米金颗粒的表面。2.待检测样品中的H6N2型禽流感病毒DNA分子或H6N2型禽流感病毒RNA经环介导等温核酸扩增技术大量复制或先经逆转录过程后大量复制，H6N2型禽流感病毒的目标片段被放大109倍，产生的扩增产物DNA具有多重重复序列。 3.混合纳米金颗粒和环介导等温核酸扩增体系，H6N2型禽流感病毒经环介导等温核酸扩增技术以后的产物DNA与纳米金颗粒上能识别H6N2型禽流感病毒特定序列的分子探针杂交。4.纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体(如附图所示)，进而引发纳米金颗粒聚集处(例如溶液中、固体表面等)的颜色变化，依据颜色变化可以判断待测样品是否具有H6N2型禽流感病毒DNA或RNA。本发明中，纳米金颗粒探针包括两个部分，一是纳米尺度的金颗粒，另一部分是固定在纳米金颗粒表面的分子探针，该探针可以识别H6N2型禽流感病毒的特定序列。本发明中，待检测样品中环介导等温核酸扩增技术的扩增对象可以是H6N2型禽流感病毒DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。本发明中，纳米金颗粒探针和H6N2型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交可以和环介导等温核酸扩增反应在相同反应条件下、相同反应容器中同时进行。本发明中，纳米金颗粒探针和H6N2型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交可以发生在溶液中或者固体表面。本发明中，纳米金颗粒探针与H6N2型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交引发溶液或固体表面颜色改变，这种变化可由肉眼直接判断，也可利用分光光度计等光学仪器检测。本发明中，分子探针是指可以识别H6N2型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产物DNA的功能分子，这些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白质，化学分子。本发明中，相同反应条件包括但不限于溶液组成，成分浓度，PH值，温度，反应时间等。本发明的优势本发明试剂盒结合环介导等温核酸扩增技术和生物纳米技术，提高生物分子检测的灵敏度，是一种操作简单、快速、准确、成本低廉、不需要专业仪器设备的方法，可以广泛应用于家庭诊断、临床诊断、传染病控制、环境监测、检验检疫，生物技术等领域的高灵敏度的H6N2型禽流感病毒检测。
图I为标记有分子探针的纳米金颗粒与H6N2型禽流感病毒经环介导等温核酸扩增技术以后的产物DNA杂交示意图，纳米金颗粒沿柯H6N2型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体。
具体实施例本发明试剂盒包括2管溶液，一管中是标记有可以识别H6N2型禽流感病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒溶液50 μ 1，一管中是250 μ I可以扩增待检测样品中的Η6Ν2型禽流感病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的Η6Ν2型禽流感病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。纳米金颗粒溶液中含有直径为20 nm的纳米金颗粒，浓度为I. 2 nM，纳米金颗粒表面标记有疏基修饰的DNA探针。 环介导等温核酸扩增体系成分如下0. 2 “11 3和83引物，1.6 μ M FIP和BIP引物，O. 4 M betaine (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO), 10 mM MgS04, I. 4 mM dNTPs,IX ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA), 80 U Bst DNApolymerase (New England Biolabs), 6. 25 U AMV 逆转录酶(Invitrogen, Carlsbad,CA)。巯基修饰的DNA探针序列
5，-GCTCTCATGGAATGGCTAAAAAAAAAAAA-SH-3，。H6N2型禽流感病毒的F3弓丨物序列
5’-AGACAAGACCAATCCTGTCAC-3’ 。H6N2型禽流感病毒的B3弓丨物序列
5’-CTCTGACTAAGGGGATTTTG-3’ 。H6N2型禽流感病毒的FIP引物序列
5’-GGGTTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCA-3’ 。H6N2型禽流感病毒的BIP引物序列
5，-CAAAATGCACTAAATGGAAATGGAGACCCAAACAACAT-3，。操作过程如下1.向装有环介导等温核酸扩增体系的管中加入10 μ I提取的核酸或者混合样品。2.将装有混合物的管放入60° C的水浴中30分钟。3.再向步骤2中的管中加入纳米金颗粒溶液，此时混合后的溶液为红色。4. 60° C水浴反应15分钟。观察反应后管中溶液的颜色，溶液保持红色不变则不含有Η6Ν2型禽流感病毒感染特异性RNA或Η6Ν2型禽流感病毒DNA ;如果溶液变为浅紫色，则判定样本中含有Η6Ν2型禽流感病毒感染特异性的RNA或Η6Ν2型禽流感病毒DNA。
权利要求
1.一种用纳米金颗粒检测H6N2型禽流感病毒经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下部分(I)标记有可以识别H6N2型禽流感病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒；(2)可以扩增待检测样品中的H6N2型禽流感病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的H6N2型禽流感病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。
2.根据权利要求1，该试剂盒的工作原理为(I)用环介导等温核酸扩增技术扩增待检测样品中的H6N2型禽流感病毒DNA或先经过逆转录过程后用环介导等温核酸扩增技术扩增待检测样品中的H6N2型禽流感病毒RNA ； (2)纳米金颗粒探针与环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交；(3)杂交引发纳米金颗粒聚集，导致纳米金颗粒聚集处颜色改变，以此判断待检测样品是否含有H6N2型禽流感病毒DNA或RNA。
3.根据权利要求1，纳米金颗粒探针包括两个部分，一是纳米尺度的金颗粒，另一部分是固定在纳米金颗粒表面的分子探针，该探针可以识别H6N2型禽流感病毒的特定序列。
4.根据权利要求2，待检测样品中环介导等温核酸扩增技术的扩增对象可以是H6N2型禽流感病毒DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。
5.根据权利要求2，纳米金颗粒探针和H6N2型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交可以和环介导等温核酸扩增反应在相同反应条件下、相同反应容器中同时进行。
6.根据权利要求2，纳米金颗粒探针和H6N2型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交可以发生在溶液中或者固体表面。
7.根据权利要求2，纳米金颗粒探针与H6N2型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产物DNA杂交引发溶液或固体表面颜色改变，这种变化可由肉眼直接判断，也可利用分光光度计等光学仪器检测。
8.根据权利要求3，分子探针是指可以识别H6N2型禽流感病毒环介导等温核酸扩增技术产物DNA的功能分子，这些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白质，化学分子。
9.根据权利要求4，相同反应条件包括但不限于溶液组成，成分浓度，PH值，温度，反应时间等。
全文摘要
本发明涉及一种用纳米金颗粒检测H6N2型禽流感病毒DNA经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明结合环介导等温核酸扩增技术和生物纳米技术，提高生物分子检测的灵敏度，是一种操作简单、快速、准确、不需要专业仪器设备的方法，可以广泛应用于家庭诊断、临床诊断、传染病控制、环境监测、检验检疫，生物技术等领域的高灵敏度的H6N2型禽流感病毒检测。本发明试剂盒包括两部分(1)标记有可以识别H6N2型禽流感病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒；(2)可以扩增待检测样品中的H6N2型禽流感病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的H6N2型禽流感病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。
文档编号C12R1/93GK102851405SQ201210399900
公开日2013年1月2日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者不公告发明人 申请人:天津朝海科技有限公司