专利名称：一种预测前列腺癌易感性的检测试剂盒和方法
技术领域：
本发明涉及一种预测前列腺癌易感性的检测试剂盒和方法，更具体的说是通过测定与前列腺癌相关基因F0XP4基因5’端附近rs4714476位点多态性预测受试者对于前列腺癌的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断和新药开发，属于生物技术领域。
背景技术：
前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性最常见的与老龄相关的恶性肿瘤,其发病机制尚不清楚，家族史和双生子研究表明遗传因素是PCa发生的一个重要危险因素。随着我国老龄化人口的增长，PCa的发病率正逐年增长(刘振伟，项永兵，张薇.上海市区1973 1999年PCa发病趋势分析·中国卫生统计，2003，20 (6) : 335-337.)，目前PCa特异性抗原(prostate specific antigen, PSA)在PCa筛查中的应用引起众多争议,现有的PCa筛查又多依赖PSA水平的检测，临床上发现，由于PSA检测精度的特异性和敏感性不足，带来了 PCa的诊断不足和过度治疗的严重问题。然目前尚未见有替代PSA的临床早期筛查PCa技术的研究，原因是缺乏有效的PCa生物标志。研究表明越来越多的PCa遗传标志物的发现为PCa早期诊断提供了可能。随着大规模全基因组关联研究(Genome-Wide Association Studies, GWAS)的出现，目前国外已经通过这种方法鉴定了 50多个PCa易感SNPs位点，约解释25%的PCa遗传病因。证明了 SNPs作为基因组标志的关联分析方法在PCa遗传研究中的有效性。SNPs是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需>1%，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70. 1%为同型碱基之间的转换如G/A或T/C，29. 1%为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C (胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化 胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T (胸腺嘧啶)，SNPs包含了已知多态性的80-90%，是最常见的遗传变异。由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNPs以其密度高(平均每Ikb就有I个)、代表性强(位于基因内部的SNPs可能直接影响蛋白质结构或表达水平)、遗传稳定性好(同微卫星多态性比较而言)、易于自动化分析(因SNPs在人群中为双等位基因标记，可简单以“+ / 一或1/0”直接分型)等特点成为很好的遗传标志。F0XP4 (叉头转录因子P4) (forkhead box P4，F0XP4)基因是FOX转录因子家族的P亚家族，在胚胎发育、细胞周期调节和肿瘤形成中起主要作用，在野生小鼠组织和人类肿瘤组织中，F0XP4在肾癌患者组织中表达明显减少，Frohme et al.等研究也证明在喉癌时F0XP4的表达也减少。证明了 F0XP4基因与肿瘤的相关性。目前，F0XP4在PCa中可能的作用还未被研究，然而，在与PCa发病机制及遗传机制相似的乳腺癌中，已经鉴定了 F0XP4基因的变异或异位改变。F0XP4基因上的PCa易感SNP位点rsl983891是2010年Takata R等在日本人群中GWAS研究鉴定的，F0XP4基因位于6p21，rsl983891位于F0XP4基因第2内含子，目前这一位点与PCa的关联性在欧洲、中国人群中已经被复制验证，而F0XP4基因及附近其他位点与PCa的风险还未见有研究报道，我们结合以上F0XP4与其他肿瘤有关的功能，在此基因及基因两端5KB内选择SNPs进行分型并分析了与PCa及PCa相关临床表型的相关性，鉴定出位于F0XP4基因5’端附近的rs4714476与PCa及PCa相关的临床信息关联。Rs4714476 位于 6p 上 F0XP4 基因 5’端附近，F0XP4 基因全长 55. 96kbp，在 6p21 上位置从 41，622，142 到 41，678，099，rs4714476 在染色体上位置为 41，621，717，距离 F0XP4基因仅425bp，可能会对F0XP4基因转录有调节作用，或者连锁有转录起始区的功能位点，经查询检索，截至目前，尚未见有F0XP4基因5’端附近rs4714476位点多态性与PCa的风险未见报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种检测前列腺癌易感性基因的方法。本发明的第二个目的是提供一种检测前列腺癌易感性基因的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，为序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。所述核苷酸序列为F0XP4基因5’端附近包含单苷酸多态性位点rs4714476的核苷酸片段。图1为F0XP4基因结构及rs4714476多态性变异位点的示意图，rs47144768位点标在F0XP4基因图中5’端附近的相应位置。所述单苷酸多态性位点rs4714476的基因型为CC或TC时，前列腺癌易感性最高；基因型为TT时，前列腺癌 易感性较低。该基因型位点差异还可预测受试者前列腺癌临床表型与正常对照人群相比较，F0XP4基因5’端附近rs4714476的基因型为CC或TC时，前列腺癌患者中诊断年龄彡65岁，PSA (PCa特异性抗原)水平>20ng/ml，肿瘤分期〈III及进展性前列腺癌的发生率都将明显高于TT基因型的患者。一组检测前列腺癌易感性的引物，能扩增得到权利要求1所述的检测前列腺癌易感性的核苷酸序列。所述引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示。一种前列腺癌易感性基因的检测方法，包括如下步骤(I)抽提样品的基因组DNA，扩增F0XP4基因5’端附近包含单苷酸多态性位点rs4714476的核苷酸片段；(2)检测步骤(I)产物中单苷酸多态性位点rs4714476的基因型，基因型为CC或TC时，前列腺癌易感性最高；基因型为TT时，前列腺癌易感性较低。所述步骤(I)中的核苷酸片段为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，rs4714476位点位于该核苷酸序列的+301位。所述扩增F0XP4基因5’端附近包含单苷酸多态性位点rs4714476的核苷酸片段，使用的一组引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示。本发明提供了一种检测前列腺癌易感基因的试剂盒，其中含有本发明特异性扩增F0XP4基因5’端附近rs4714476位点的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下一种预测PCa的试剂盒，供10人份检测应用，由以下试剂组成10 μ L 10XPCR 缓冲液(购自 Pharmacia)，2 μ L IOmM dNTP 混合液(购自 Pharmacia)，2 μ L Taq DNA 聚合酶(2unit/μ L)(购自 Takara)，1μL Fl引物，为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μ L ；1uL Rl引物，为SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μ L ；8 μ L IOXLC-green PLUS 饱和荧光染料；2μ L寡核苷酸内参引物各0. 5μ L，浓度为10pmol/μ L，其中低温内参引物F为SEQID NO. 4所示的核苷酸序列，低温内参引物R为SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高温内参引物F为SEQ ID NO. 6所示的序列，高温内参引物R为SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；64 μ L 纯水。使用方法1) PCR扩增通过PCR扩增F0XP4基因5’端附近部分片段，制备混合液=IOXPCR反应缓冲液 lyL，10mmol/L dNTP 0. 2 μ L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 μ L，10pmol/L 上游引物
0.lμL，10pmol/L下游引物O.1μL, 10XLC Green PLUS饱和荧光染料0. 8 μ L，寡核苷酸内参0. 2 μ L (高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0. 05 μ L)(序列见表1)，基因组DNAl μ L，加去离子水至10 μ Lo PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s，总共45个循环，72°C总延伸7min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理95°C 30s, 25°C 2min，94°C 30s，24°C 4min。PCR 时于每一体系中加入 20 μ l 的石蜡油，以防止液体挥发。2)基因型判定将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light scanner TMHR-196上进行HRM分析，用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，根据熔解曲线的差异判定基因型。F0XP4基因5’端附近单苷酸多态性位点rs4714476在制备诊断或治疗前列腺癌的试剂或药物中的用途。本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如体液(血液、腹水及尿液等)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含F0XP4基因5’端附近突变位点rs4714476的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含F0XP4基因5’端附近突变位点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据F0XP4基因5’端附近突变位点rs4714476突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试齐U，其对应于用于测定rs4714476基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩增步骤的引物。本发明的优点是本发明首次阐明了 F0XP4基因5’端附近rs4714476多态性位点与PCa的相关性，提供了一种预测PCa易感性的方法和检测试剂，该方法可用于PCa的辅助诊断和新药研发。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步叙述，以便公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为F0XP4基因结构及5’附近端多态性变异位点的示意2为F0XP4基因5’附近端rs600928位点经HRM分型溶解曲线3为F0XP4基因5’附近端rs600928位点的测序图
具体实施例方式用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下10XPCR 缓冲液10mM Tris-HCI (ρΗ=8· 3)，500mM 氯化钾(KC1)，IOmM 氯化镁(MgCl2)7O. 01%(W/V)白明胶dNTP :脱氧核苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸二钠 TE IOmM Tris-HCl (pH=7. 5)，ImM EDTA (pH=8. O)实施例1 :血液样本收集和基因组DNA的提取(I)PCa患者均经组织病理学诊断，共选取来自北京和天津地区无血缘关系的PCa患者277例(年龄46 - 93岁，平均72. 3岁)，同地区的年龄匹配的对照602例(年龄58 - 94岁，平均70. 5岁)，均为男性，无PCa家族史、DRE阴性并且PSA〈4ng/mL。所有受检者均为汉族且签署书面知情同意书，这项研究得到卫生部北京医院，卫生部老年医学研究所伦理审核委员会的认可，符合世界医学会赫尔辛基宣言人体医学研究的伦理原则。(2)根据下列方法，制备人基因组DNA。①首先在已标号的1.5mLEP管中加1000 μ L红细胞裂解液，后加入400 μ LEDTA抗凝血(抗凝血加入前颠倒混匀3-5次)，颠倒混匀，室温静置10分钟；②13000rpm离心30秒后，除去上清液；③在所得沉淀中加480 μ I核酸裂解液，弹击管壁，充分混匀后加入20 μ L蛋白酶K (用裂核液稀释20倍稀释蛋白酶K)，颠倒混匀，65°C孵箱10分钟，(期间不时上下混匀，确保无凝块)；④拿出后降至室温，加300mL蛋白沉淀液，充分颠倒混匀，静置10分钟，13000rpm离心2分钟；⑤将上清液移至新EP管中，加入670 μ L预冷的异丙醇，充分颠倒混匀(10次以上)，可见线状DNA逐渐形成小团块，13000rpm离心2分钟；⑥弃上清液并确保沉淀留在EP中，加入670 μ L 70%乙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心2分钟；⑦弃上清，使管内乙醇挥发干净；⑧加入TE溶解液(400 μ L)，充分溶解，然后对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析，吸取部分DNA溶液作为工作液，浓度校正至20ng/l·! L，放置于4°C备用，剩余基因组DNA置_20°C冰箱保存。实施例2SNP的识别鉴定 本发明采用PCR-高分辨率溶解曲线(HRM)分析法和PCR测序技术同时对F0XP4基因3’端附近基因区的rs4714476位点(其等位位点为C/T)的基因型进行检测。I) PCR-HRM弓丨物的确定从Genebank中查取rs4714476附近的DNA碱基序列(SEQ ID NO.1),引物设计在Oligo 6. O和primer5. O软件下完成。目的片段定位在F0XP4基因5’near gene区，全长61bp，确定了正义链Fl (+271bp—+291bp)与反义链Rl (+315bp—+331bp)，特异性引物序列如下Fl :5，-ACCGTGTGGGATCAGGACTTG-3’ (SEQ ID NO. 2)Rl :5，-TTGCAAACCCCGGCCAT-3，(SEQ ID NO. 3)2 ) PCR-HRM反应体系及条件通过PCR扩增F0XP4的5’端附近基因区的rs4714476位点所在片段，PCR反应体系为10XPCR 反应缓冲液 I μ L，10mmol/L dNTP O. 2 μ L, Taq DNA 聚合酶 O. 2 μ L，IOpmol/L上游引物0. lyL，10pmol/L下游引物O.1yL, 10XLC Green PLUS饱和荧光染料O. 8 μ L，寡核苷酸内参O. 2 μ L (高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各O. 05 μ L，3’端C3封闭，阻止延伸，见表1)，基因组DNA I μ L，加去离子水至10μ L。PCR时于每一体系中加入20 μ I的石蜡油，防止液体挥发。PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s，总共45个循环，72°C总延伸7min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理95°C 30s，25°C 2min，94°C 30s,24°C 4min。表I高、低温寡核苷酸内参引物序列、退火温度及产物片段长度
权利要求
1.一种检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于为序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列为F0XP4基因5’端附近包含单苷酸多态性位点rs4714476的核苷酸片段。
3.根据权利要求2所述的检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于所述单苷酸 多态性位点rs4714476的基因型为CC或TC时，前列腺癌易感性最高；基因型为TT时，前列腺癌易感性较低。
4.一组检测前列腺癌易感性的引物，其特征在于能扩增得到权利要求1所述的检测前列腺癌易感性的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的一组检测前列腺癌易感性的引物，其特征在于所述引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示。
6.一种前列腺癌易感性基因的检测方法，其特征在于包括如下步骤 Cl)抽提样品的基因组DNA，扩增F0XP4基因5’端附近包含单苷酸多态性位点rs4714476的核苷酸片段； (2)检测步骤(I)产物中单苷酸多态性位点rs4714476的基因型，基因型为CC或TC时，前列腺癌易感性最高；基因型为TT时，前列腺癌易感性较低。
7.根据权利要求6所述的前列腺癌易感性基因的检测方法，其特征在于所述步骤(I)中的核苷酸片段为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，rs4714476位点位于该核苷酸序列的+301位。
8.根据权利要求6所述的前列腺癌易感性基因的检测方法，其特征在于所述扩增F0XP4基因5’端附近包含单苷酸多态性位点rs4714476的核苷酸片段，使用的一组引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示。
9.一种检测前列腺癌易感基因的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成10 μ L 10 X PCR 缓冲液； 2 μ L IOmM dNTP 混合液；2 μ L Taq DNA 聚合酶，2unit/ μ L ； IuL Fl引物，为SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/yL; IuL Rl引物，为SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，浓度为IOpmol/μ L ； 8 μ L 10 X LC-green PLUS 饱和荧光染料； 2 μ L寡核苷酸内参引物各O. 5 μ L，浓度为IOpmol/ μ L，其中低温内参引物F为SEQ IDNO. 4所示的核苷酸序列，低温内参引物R为SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高温内参引物F为SEQ ID NO. 6所示的序列，高温内参引物R为SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列； 64 μ L纯水。
10.F0XP4基因5’端附近单苷酸多态性位点rs4714476在制备诊断或治疗前列腺癌的试剂或药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种预测前列腺癌易感性的检测试剂盒和方法，属于生物技术领域。本发明通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的FOXP4基因5’端附近rs4714476位点的基因型，预测受试者对前列腺癌的易感性FOXP4基因5’端附近rs4714476的基因型为CC或TC时，受试者的易感性较高，rs4714476的基因型为TT时，受试者的易感性最低；并可预测受试者前列腺癌临床表型。肿瘤分期<III及进展性前列腺癌的发生率都将明显高于TT基因型的患者。本发明的优点是首次阐述了rs4714476基因多态性位点与前列腺癌及前列腺癌临床信息的相关性，提供了一种预测前列腺癌易感性的方法，该方法可用于前列腺癌的早期预防诊断、临床辅助诊断，还可以用于新药研发。
文档编号C12N15/11GK103060315SQ20121039920
公开日2013年4月24日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者杨泽, 刘铭, 王建业, 史晓红, 魏东, 朱小泉, 杨帆, 张耀光, 梁思颖, 唐雷, 孙亮 申请人:卫生部北京医院