专利名称：一种鉴定大豆疫霉β-微管蛋白基因核苷酸点突变及其对苯酰菌胺抗药性的方法
技术领域：
本发明涉及大豆疫霉β-微管蛋白基因的克隆及其在杀菌剂苯酰菌胺抗性监测中的应用，具体公开一种快速鉴定大豆疫霉β-微管蛋白基因核苷酸点突变及其对苯酰菌胺抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学技术领域。
背景技术：
大豆疫病是由大豆疫霉(Phytophthorasojae Kaufmann&Gerdemann)引起的一种具有危险性、毁灭性的卵菌病害。其在大豆各生育期均可发病，其中感病品种一般减产25% 50%，高感品种可达90%以上，甚至绝收；并且籽粒蛋白含量明显下降，使用价值受到影响。该病害自1948年在美国印第安纳州东北部首次被发现后，迅速扩展到巴西、阿根廷等20多个国家。在我国则主要发生在黑龙江、安徽、福建等省，为重要的外检和内检病 害。大豆疫霉为同宗配合的卵菌，自然条件下即可发生有性生殖，加速了基因的重组与交换，使得田间大豆疫霉菌株的遗传多样性越来越丰富；而且大豆疫霉生理小种毒性变异明显，新小种层出不穷，许多大豆抗性基因已被新的小种所克服，抗病资源失去效用。而化学防治的快速有效，使之成为该病害防治中较为重要的措施。但目前国内外专门用于卵菌病害防治的杀菌剂种类较少，其中最具有代表性的是以甲霜灵为代表的苯酰胺类杀菌齐U，是第一代专门用于防治卵菌病害的一大类重要的内吸性杀菌剂。然而，由于该类杀菌剂的作用位点较为单一，而且大面积广泛使用，致使病原菌对该类药剂的抗药性接踵而至，并且发展迅速，目前病原菌对甲霜灵的抗性问题已尤为严重。而苯酰菌胺(zoxamide)则是在此背景下应运而生的一种对卵菌具有特效的苯甲酰胺类杀菌剂，是目前市场上唯一一种作用于微管蛋白的杀卵剂。该类杀菌剂在2001年开始商品化，并已在欧美地区广泛使用，在我国也已正处于登记推广当中。尽管苯酰菌胺主要用来防治卵菌病害，它对Botrytis cinerea、Venturiainaequalis、Monilinia fructicola>Mycosphaerella fijiensis和Cercospora beticola等病原真菌也具有一定的活性。已有研究表明苯酰菌胺与苯并咪唑类杀菌剂具有类似的作用机制，均作用于靶标菌的β_微管蛋白。以多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂在田间使用后，抗药性问题很快产生并日益严重，FRAC(Fungicide Resistance Action Committee)将其列为高等抗性风险的杀菌剂。已有报道表明，苯并咪唑类杀菌剂的抗性主要是由于病原菌微管蛋白第198位和200位氨基酸发生了位点突变所造成，并且已建立了相应的田间快速检测方法，包括等位基因特异性PCR(Allele-specific polymerase chainreaction, AS-PCR)等。目前，大豆疫霉对苯酰菌胺的抗药性分子机制还未明确，而明确其具体的抗性基因，建立抗性分子检测方法，可以对抗性菌株进行早期检测，了解其抗性发展的动态，制定合理的病害管理方案，以延缓抗药性的产生。传统生物学方法和分子生物学方法是植物病原菌抗药性检测或监测中常见的两种方法。传统生物学方法即是指测定药剂对病原菌的EC5tl以区分敏感和抗性菌株，需要多个药剂处理，多次重复，检测周期长、工作量大、消耗的人力资源和材料较多；而且这种方法检测灵敏度低，要求抗药性菌株的突变频率在I %以上。而分子生物学方法，从提DNA到特异性PCR或酶切分析，检测所需时间短、检测的灵敏度高，检测频率在10_5 10_4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法。
发明内容
本发明旨在提供一种检测或辅助检测大豆疫霉中β_微管蛋白基因是否存在突变位点的方法及其专用弓I物对。本发明所提供的检测或辅助检测大豆疫霉中β_微管蛋白基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤以待测大豆疫霉的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为288bp的片段，则所述待测大豆疫霉中β _微管蛋白基 因存在或候选存在突变位点；所述突变位点是指大豆疫霉中β -微管蛋白基因的基因组序列自5’末端起第716位核苷酸为C。所述大豆疫霉中β-微管蛋白基因的基因组序列自5’末端起第716位核苷酸也就是SEQ ID NO :3中自5’末端起第716位核苷酸。上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为67V。本发明所提供的检测或辅助检测大豆疫霉中β_微管蛋白基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示DNA分子组成。本发明的另一个目的是提供大豆疫霉中β_微管蛋白基因或蛋白的突变位点，其中扩增β-微管蛋白基因全序列的引物由SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示DNA分子组成，退火温度为63. 5°C。本发明所提供的大豆疫霉中β_微管蛋白基因的一个突变位点，为大豆疫霉中β-微管蛋白的基因组序列自5’末端起716位核苷酸为C。所述β_微管蛋白基因的基因组序列自5’末端起第716位核苷酸也就是SEQ ID NO :3中自5’末端起的第716位核苷酸。本发明所提供的大豆疫霉中微管蛋白的一个突变位点，为大豆疫霉中微管蛋白自N端起第239位氨基酸为丝氨酸。所述β -微管蛋白自N端起第239位氨基酸也就是SEQ ID NO :4中自5’末端起的第239位氨基酸。以上任一所述突变位点在鉴定大豆疫霉抗药性中的应用也属于本发明的保护范围；所述抗药性为抗苯酰菌胺。上述应用中，存在所述突变位点的大豆疫霉具有或候选具有对苯酰菌胺的抗药性。SEQ ID NO :3所示基因或SEQ ID NO :4所示蛋白也属于本发明的保护范围。本发明提供的检测大豆疫霉对苯酰菌胺产生抗药性的点突变的方法，可以用于快速、灵敏地检测田间大豆疫霉对苯酰菌胺的抗性发生发展动态，为抗药性的治理提供技术支持，便于及时调整病害防治策略，以延缓和控制抗药性的进一步发展。
图1，图2为对苯酰菌胺表现抗性和敏感的大豆疫霉菌株微管蛋白基因全序列和蛋白序列比对结果，发现与抗性相关的一个突变位点。其中，Ps9、Psl3、Ps52、Ps53、AH1302 和 PsJMS2 为敏感菌株，RZ2-2、RZ5-1、RZ6-2、RZ9-2、RZlO-U RZ12-1、RZ14-1 及RZ15-1为抗性菌株。图3为采用不同AS-PCR引物进行温度梯度PCR扩增电泳图，表明各个引物的特异性存在差异。S :敏感菌株；R :抗性菌株；由上至下正向引物依次为RZ-FA、RZ-FT、RZ-FC及RZ-FG，反向引物均为SRZ-A。图4为采用特异性引物RZ-FC和SRZ-A扩增对苯酰菌胺表现敏感和抗性的大豆疫霉菌株的 AS-PCR 电泳图。Marker DNA Marker II ;RZ2_2、RZ6-2、RZ9-2、RZ10-1 及 RZ8-2 为抗性菌株；PsJMS2、Ps6、Ps4、Psl3和Ps52为敏感菌株；CK为阴性对照。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。文中“抗性菌株”均指对苯酰菌胺抗性的大豆疫霉菌株；“敏感菌株”均指对苯酰囷胺敏感的大 疫霉囷株。下述实施例中使用的大豆疫霉菌株为抗性菌株RZ2-2、RZ5-1、RZ6-2、RZ9-2、RZlO-U RZ12-1、RZ14-1 及 RZ15-1 ;敏感菌株 Ps4、Ps6、Ps9、Psl3、Ps52、Ps53、AH1302 和PsJMS2。上述菌株Ps4、Ps6、Ps9、Psl3、Ps52及Ps53均采自于中国福建地区，其中Ps4、Ps6、Ps9和Psl3由福建省农业科学院陈福如研究员馈赠，Ps52和Ps53由中国农业科学院朱振东研究员馈赠；AH1302采自于中国安徽地区，由安徽省农业科学院戚仁德研究员馈赠；PsJMS2采自于中国黑龙江地区，由中国农业科学院朱振东研究员馈赠。抗性菌株RZ2-2、RZ5-l、RZ6-2、RZ9-2、RZ10-1、RZ12-1、RZ14-1及RZ15-1均通过药剂驯化的方法获得，亲本菌株均为PsJMS2。以上菌株均经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定为大豆疫霉菌株。上述各个菌株均经过菌落生长速率法进行敏感性测定和抗药性验证。实施例I、大豆疫霉对苯酰菌胺的敏感性测定8 株敏感菌株 Ps4、Ps6、Ps9、Psl3、Ps52、Ps53、AH1302 和 PsJMS2 ；8 株抗性菌株RZ2-2、RZ5-1、RZ6-2、RZ9-2、RZ10-1、RZ12-1、RZ14-1 及 RZ15-1。胡萝卜培养基胡萝卜200g，榨汁，4层纱布过滤，蒸馏水定容至1L，121°C湿热灭菌20分钟。I、实验步骤如下I)将苯酰菌胺用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide DMS0)配成IO5 μ g/mL的母液。将苯酰菌胺逐级稀释成 200 μ g/mL、300 μ g/mL>400 μ g/mL、500 μ g/mL、600 μ g/mL 和700 μ g/mL的浓度梯度，1%0 DMSO作为空白对照，以测定8株大豆疫霉敏感菌株的敏感性。对于8株大豆疫霉抗性菌株的敏感性测定，1%。DMSO作为空白对照，测定其在IO5 μ g/mL浓度下的抑制率。
2)按由低到高的顺序，用移液枪吸取各个浓度梯度的药液480μ L加入已灭菌的冷却至45°C的480mL胡萝卜培养基中，使溶剂含量为1%。，混匀，将带药的培养基倒入直径为9cm的培养皿中，以只加480 μ L DMSO的处理为空白对照。每个浓度重复3次。3)取25°C下黑暗培养4天后的大豆疫霉菌株，沿菌落边缘用打孔器打取直径为O. 5cm的菌饼，菌丝面向下接种于步骤2)中的带药和对照平板中，置于25°C培养箱中黑暗培养，4d后测量菌落直径。4)十字交叉法测量菌落直径，根据菌落平均直径值计算出各个浓度下对供试菌株的菌丝生长的抑制率。然后将抑制率转化成机率值(Y)，药剂浓度转换成以10为底的对数值(X),在Microsoft Excel中作回归直线,分别求出各个供试大豆疫霉菌株对苯酰菌胺的毒力回归曲线方程Y = a+bX,以及相关系数r和有效抑制中浓度EC5tl值，
权利要求
1.一种检测或辅助检测大豆疫霉中β-微管蛋白基因或对应蛋白是否存在位点突变的方法，步骤如下 以待测大豆疫霉的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为288bp的片段，则所述待测大豆疫霉中β _微管蛋白基因存在或候选存在突变位点； 所述突变位点指大豆疫霉中β_微管蛋白基因的基因组序列自5’末端起第716位核苷酸为C。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR扩增中，退火温度为67V。
3.—种检测或辅助检测大豆疫霉中β_微管蛋白基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示 DNA 分子组成。
4.大豆疫霉中β_微管蛋白基因的一个突变位点，为大豆疫霉中β_微管蛋白基因的基因组序列自5’末端起第716位核苷酸为C。
5.一种扩增大豆疫霉微管蛋白基因全序列的引物对，由SEQ ID NO :5和SEQID NO 6所示DNA分子组成，PCR扩增中，退火温度为63. 5°C。
6.大 疫霉中β_微管蛋白的Iv突变位点，为大 疫霉中β_微管蛋白的自N端起第239位氨基酸为丝氨酸(Ser，S)。
7.权利要求4或6所述突变位点在鉴定大豆疫霉抗药性中的应用；所述抗药性是指对苯酰菌胺的抗药性。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于存在所述突变位点的大豆疫霉具有或候选具有对苯酰菌胺的抗药性。
9.SEQ ID NO 3所示基因。
10.SEQ ID NO 4 所示蛋白。
全文摘要
本发明涉及大豆疫霉β-微管蛋白基因的克隆，突变位点的鉴定及其在苯酰菌胺(zoxamide)抗性监测中的应用，具体公开了一种鉴定大豆疫霉β-微管蛋白基因的716位核苷酸突变对苯酰菌胺产生抗药性的分子检测方法及专用引物。该引物对，由SEQID NO1和SEQ ID NO2所示DNA分子组成，PCR退火温度为67℃。本发明提供的检测大豆疫霉对苯酰菌胺抗药性的分子诊断方法，具有灵敏度高、简捷快速、稳定性好的特点，可以用于高通量地检测田间大豆疫霉对苯酰菌胺的抗性发生发展动态，对抗药性的早期预警以及有效控制病原菌抗药性的发展具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102925565SQ20121039872
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者刘西莉, 蔡萌, 陈磊, 毕扬, 林东, 李波涛, 李健强, 刘鹏飞 申请人:中国农业大学