一种疫霉诱导性人工合成启动子pmp3及其重组表达载体和应用
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，公开一种疫霉诱导性人工合成启动子PMP3及其重组表达载体和应用，该启动子是以AAAGAC顺式元件及其上游9bp和下游15bp的侧翼序列为核心序列。取该顺式元件及其在基因启动子中上游9bp和下游15bp的侧翼序列，共30bp的序列，人工合成四聚体序列作为启动子PMP3，将PMP3融合GUS报告基因构建到植物表达载体pMDC162中，并通过农杆菌介导的烟草瞬时表达系统，对启动子的病原菌诱导表达特性进行分析。结果发现人工合成PMP3启动子能在疫霉菌的诱导下快速、高效的驱动GUS报告基因的上调诱导表达。由此可见，人工合成PMP3启动子是病原诱导性启动子，为植物抗疫霉基因工程提供有价值的病原诱导性启动子。
【专利说明】
一种疫霉诱导性人工合成启动子PMP3及其重组表达载体和 应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种疫霉诱导性人工合成启动子PMP3及其重组表 达载体和该疫霉诱导性启动子、重组表达载体的应用。
【背景技术】
[0002] 有效控制植物病害一直是植物病理学研究的核心问题。长期以来，使用化学农药 是病害控制的主要技术，但在实际应用中面临的问题是:一方面缺少有效的药剂，另一方面 在用药的过程中伴随的药害，环境污染等问题。后来又提出抗病育种策略，但因其周期长， 成本高，规模大，精准度低等一系列的问题，很难进行推广应用。随着分子生物学和生物技 术的发展，进一步提出了抗病基因工程的策略，但伴随的问题是：当组成性表达一个防卫反 应相关基因时，很难控制基因表达的精准度，往往会影响植物的正常生长发育。而病原诱导 性启动子可能为解决这一问题提供新的希望，因为病原诱导性启动子能在时空上精准的调 控基因在病原侵染点特异表达。
[0003] 疫霉属(Phytophthora)目前已经鉴定的有100多种，他们中的大多数为植物病原 菌，所引起的植物病害常具有流行性和毁灭性，故称为疫病。在生产上，控制疫霉病害的主 要方法是选育抗病品种，但随着疫霉基因组的快速进化和变异，抗病品种的抗性也会在短 时间内丧失。因此，植物抗疫霉基因工程还面临巨大的挑战。目前在生产上还缺乏功能清 楚，有应用潜力的疫霉诱导性启动子。因此利用抗病转基因工程策略，人工合成出疫霉诱导 性启动子，将为植物抗疫霉根腐病基因工程提供有价值的启动子。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是解决现有技术中对疫霉菌病害控制方法复杂、控制效果不明显， 而新型的抗病基因工程技术中缺少可用的病原诱导性启动子的问题，提供一种疫霉菌诱导 性启动子。该启动子来源于对180个疫霉诱导性启动子序列的分析，获得一个新型的顺式元 件，提取顺式元件AAAGAC及其上游9bp和下游15bp的侧翼序列，共30bp的序列，人工合成四 聚体形成启动子PMP3，将该启动子构建在植物表达载体pMDC162中，能在疫霉的诱导下特异 的驱动下游⑶S报告基因的上调表达。
[0005] 本发明的另一目的在于提供含有上述疫霉菌诱导性启动子的重组表达载体、转基 因细胞系和转基因重组菌。
[0006] 本发明的又一目的在于提供上述疫霉菌诱导性启动子及其重组表达载体的应用。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0008] -种疫霉诱导性启动子PMP3,该启动子是以AAAGAC顺式元件及其上游9bp和下游 15bp的侧翼序列（共30bp的序列）为核心序列。优选的，上游的侧翼序列为AATCAGATA，下游 的侧翼序列为ATGCATATTAGTTGA。该启动子能够在疫霉菌侵染下，快速的驱动其下游基因的 上调表达，即将其构建在GUS报告基因的上游，可以在疫霉菌的诱导下驱动GUS报告基因的 表达。
[0009] 选择GUS报告基因与疫霉诱导性启动子结合，利于检测疫霉诱导性启动子的这种 病原菌诱导表达特征；当然，如果采用任何生物技术领域可用的报告基因与该疫霉诱导性 启动子结合，能达到同样的目的，均可，比如绿色荧光蛋白GFP等。
[0010] 人工合成上述核心序列的四聚体形成疫霉诱导性启动子PMP3,即该启动子是上述 核心序列的四聚体，包含有四个重复的顺式元件AAAGAC，每个所述顺式元件AAAGAC的上游 9bp和下游15bp的侧翼序列。
[0011] 优选的，该疫霉诱导性启动子PMP3的序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0012] -种核苷酸序列，其在于该核苷酸序列中包含有上述的疫霉诱导性启动子的序 列。
[0013] 含有上述的疫霉诱导性启动子的重组表达载体、转基因细胞系和转基因重组菌。
[0014] 上述的重组表达载体，其在于该重组表达载体是将上述的疫霉诱导性启动子的序 列构建在植物表达载体的报告基因上游，所述的疫霉诱导性启动子能够在疫霉菌的诱导下 驱动报告基因的表达。本发明中所使用的报告基因为GUS报告基因，但不限于此。本发明所 使用的植物表达载体为PMDC162。但是人工合成疫霉菌诱导性启动子序列具有唯一性，植物 表达载体并不是唯一，本发明列举出的植物表达载体PMDC162只是一种更适合用于本发明 提供的目的基因的转化。
[0015]上述的疫霉诱导性启动子在构建含有疫霉诱导性启动子的重组表达载体上的应 用。
[0016] 上述的疫霉诱导性启动子在构建具有疫霉菌诱导表达的转基因植物中的应用。所 述的转基因植物优选为烟草。
[0017] 上述的核苷酸序列或含有疫霉诱导性启动子的重组表达载体在构建具有疫霉菌 诱导表达的转基因植物中的应用。
[0018] 本发明基于大豆的2888张基因芯片，通过生物信息学分析180个疫霉诱导型基因 启动子区，根据顺式结构元件的出现频率、位置分布以及与诱导性基因表达量的关系，获得 核心序列为AAAGAC的新型顺式作用元件。取该顺式元件及其在基因启动子中上游9bp和下 游15bp的侧翼序列，共30bp的序列，人工合成四聚体序列作为启动子PMP3,将PMP3融合⑶S 报告基因构建到植物表达载体PMDC162中，并通过农杆菌介导的烟草瞬时表达系统，对启动 子的病原菌诱导表达特性进行分析。结果发现人工合成PMP3启动子能在疫霉菌的诱导下快 速、高效的驱动GUS报告基因的上调诱导表达。由此可见，人工合成PMP3启动子是病原诱导 性启动子，为植物抗疫霉基因工程提供有价值的病原诱导性启动子。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 1.发明人通过大量试验，发现来源于大豆的人工合成启动子受疫霉菌的诱导，能 特异驱动下游基因的快速上调表达。因此，该启动子在植物抗疫霉基因工程中具有较强的 应用潜力。
[0021 ] 2.由于病原菌侵染速度非常快，如果能够使受侵染植物快速启动其防卫相关基因 的表达，对提高其抗病性是至关重要。本发明通过试验，证明用寄生疫霉游动孢子浸泡接种 的方法处理瞬时表达了人工合成的启动子及其重组表达载体，可以在接种后的2h检测到报 告基因的快速、高强度的表达。说明人工合成的启动子PMP3是一个疫霉诱导性启动子。
[0022] 3.提前在烟草中表达如下重组质粒：由PMP3启动子融合GUS报告基因的PMP3: :GUS 重组质粒。72h后接种寄生疫霉Pp〇25,可以在侵染后2h驱动报告基因快速上调表达。说明人 工合成的启动子PMP3是病原诱导性启动子。该启动子能在烟草瞬时表达系统中表达，在疫 霉诱导下快速驱动下游⑶S报告基因的上调表达，为植物抗疫霉基因工程提供有价值的病 原诱导性启动子，其成为植物抗疫霉基因工程的候选材料，进一步可为生产上提供有持久 抗病潜力的育种材料。
【附图说明】
[0023] 图1获得的新型顺式元件与疫霉诱导表达基因表达量的关系(A)和在启动子中的 定位(B)
[0024] 将基因芯片中受疫霉特异性诱导的180个基因分为两组:含有该顺序元件的为一 组和不含该顺式元件的为另一组。然后对比这两组基因在接种疫霉一天后诱导表达量升高 的倍数。从图IA中可以看出，含有个AAAGAC顺式元件的一组受疫霉诱导表达倍数更高。图 1B:AAAGAC顺式元件出现在基因启动子中的位置及其分布。
[0025]图2构建人工合成疫霉诱导性启动子的重组植物表达载体pMDC162示意图 [0026]图中的四个"motif"表示:将新型顺序元件AAAGAC及其在基因启动子中上游9bp和 下游15bp侧翼序列作为一个"motif"，将"motif"以串联的形式形成四个重复单元，作为人 工合成启动子PMP3,经Kpn I和BgL II双酶切后插入到该区。"35S min"是组成型CaMV35S启 动子中的-46~+8区域。最终形成人工合成PMP3启动子融合35S min和GUS报告基因的 PMDC162重组植物表达载体。
[0027]图3在烟草瞬时表达体系中检测人工合成启动子PMP3驱动⑶S报告基因表达的化 学组织染色结果
[0028]图中人工合成PMP3启动子，组成性表达强启动子（阳性对照）、不能驱动基因表达 的小启动子（阴性对照）分别在烟草上表达3d后，用辣椒疫霉P.c35游动孢子（IO5个/mL)接 种，并在接种后的Oh和2h用化学组织染色的方法检测GUS报告基因的活性。
[0029]图4在烟草瞬时表达体系中检测人工合成启动子PMP3驱动⑶S报告基因表达的酶 活及mRNA检测
[0030] A.人工合成PMP3启动子，在烟草上表达3d后，用辣椒疫霉P.C35游动孢子（IO5个/ mL)接种，并在接种后的Oh和2h检测GUS报告基因的酶活性。
[0031] B.人工合成PMP3启动子，在烟草上表达3d后，用辣椒疫霉P. C35游动孢子（IO5个/ mL)接种，并在接种后的Oh和2h用实时荧光定量PCR的方法检测GUS报告基因转录水平的表 达。
【具体实施方式】
[0032]下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段。
[0033]实施例1新型顺式元件AAAGAC的获得
[0034] 1.根据芯片数据筛选疫霉特异诱导性基因启动子结构元件
[0035] 根据三个不同的大豆品种:V71-370，VPRIL9，Sloan受大豆疫霉侵染过程全基因表 达谱的芯片数据文献（Zhou L，Mideros SX,Bao L，et al. Infection and genotype remodel the entire soybean transcriptome[J].BMC Genomics,2009,10(1):49-59.), 分析该文献中涉及的180个在大豆疫霉侵染后上调表达基因的启动子区。我们首先搜集了 一些已报到的作用元件序列，查找这些序列在这180个基因中出现的频率以及其位置分布， 并将含有这些元件的启动子在接种后Id的表达情况与不含这些元件的启动子进行比较。然 后分析这些元件在各自启动子中的位置分布。而对于新的结构元件的挑选，本发明的标准 是，在疫霉特异诱导的基因的启动子中出现频率明显高于其他它基因，并且在三个品种的 大豆中，接种疫霉Id后含有该元件的基因上调表达的情况要明显高于不含该元件的基因。 [0036] 2.顺式元件特征分析
[0037] 根据顺式结构元件的出现频率、位置分布以及与诱导性基因表达量的关系。启动 子中顺式元件通常含有5~9个碱基，我们将5、6、7、8、9个碱基的不同组合全部列出，然后寻 找每种碱基组合在180个疫霉特异性诱导基因中出现的频率，并在大豆基因组中挑选180个 基因，分析每种碱基组合在180个的基因中出现的频率，同已知顺序元件出现的频率相比较 得出显著性。挑取P <0.01的碱基组合，用分析已知顺式元件的方法分析其与表达量的关 系，并挑选在三个大豆品种中，表达量变化趋势一致的碱基组合。经过以上分析，我们共获 得25个新的顺式元件。
[0038] 本发明所涉及到的新型顺式元件AAAGAC是其中的一个，当基因中含有该顺式元件 时，其疫霉诱导表达量高于不含该顺式元件基因，据此我们推测这些顺式元件可能在大豆 基因受疫霉诱导表达方面起着重要作用，结果见图1A。而图IB则是各结构元件在启动子中 位置的统计，该顺式元件在基因启动子中分布没有明显的趋向性。
[0039] 实施例2人工合成的PMP3启动子是疫霉诱导性启动子
[0040] 1.人工启动子的合成与载体构建
[0041] 将由生物信息学分析获得的新型顺式元件AAAGAC，及其上游9bp和下游15bp的侧 翼序列，共30bp，人工合成这30bp的四个重复单元，作为人工合成启动子PMP3的序列（如SEQ ID NO.5所示），用于构建植物表达载体。
[0042] 根据 Chai C,Lin Y1Shen D , et al . Identification and Functional Characterization of the Soybean GmaPPOI2Promoter Conferring Phytophthora sojae Induced Expression[J] .PloS One,2013,8(6) :1_6.文章中构建启动子融合GUS报 告基因的植物表达载体方法获得由四个重复单元融合⑶S报告基因的PMP3::⑶S重组质粒， 载体的构建模式图如图2所示。
[0043] 2.农杆菌介导的本氏烟瞬时表达与接种
[0044] 将PMP3: :GUS重组质粒的植物表达载体pMDC162通过电转化技术转入GV3101农杆 菌(Biovector)菌株(该菌株为本领域技术人员公知的植物转化常用菌株，南京农业大学大 豆疫霉与植物互作实验室保存）中，将农杆菌的阳性转化子于3ml添加卡那霉素（50yg/mL) 的LB培养液中，220rpm，28-30°C培养48h，4000rpm离心4min，收集菌体，用IOmM MgCl2重悬， 重复三次后，用IOmM MgCl2定容至OD 600 = 0.4~0.6。取生长6-8周的烟草，从上数第三至 第六片完全展开的真叶被用于渗透接种农杆菌。用针头在烟草下表皮造成一小伤口，用ImL 无针头的注射器将30-50yL农杆菌悬液渗透到本氏烟叶片中。注射后72h接种。剪下注射的 烟草叶片，浸泡在辣椒疫霉孢子悬浮液中，孢子浓度为IO 5个/mL，分别在接种后0,和2h取 样，迅速用液氮冻存，以备检测GUS酶活性，或用浸泡在GUS染液中用于GUS染色。实验重复三 次，每次设三个生物学重复，用于检测烟草瞬时表达体系中的疫霉诱导表达的报告基因 GUS 活性。
[0045] 3. GUS活性分析
[0046] 3 · IGUS化学组织染色
[0047] 参照Jefferson等方法（Jefferson RA，Kavanagh TA，Bevan MW.GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[ J].EMBO J，1987,6(13):3901-3907.)测定烟草叶片和根毛中的GUS报告基因的表 达。将需要染色的叶片(来源于实例2的样品材料)浸泡在⑶S染液(50mmoI I/1磷酸钠缓冲液 pH 7.0, IOmol L-1EDTA, Immol !/1X-Gluc，0· I%Triton X-100，IOmmol !/1P-疏基乙醇）中， 置于37°C温育12h，75%乙醇冲洗两次，再用95%乙醇脱色，直至底色完全消失。分别在烟草 上表达3d后，用辣椒疫霉P. c35游动孢子（IO5个/mL)接种，并在接种后的0，和2h用化学组织 染色的方法检测⑶S报告基因的活性。图3显示的是重组质粒瞬时表达烟草的化学组织染色 结果，结果表明:PMP3启动子能在瞬时转化的烟草叶片上驱动报告基因的表达，表现为染色 的蓝色深度在2h时比与Oh的颜色深;在2h GUS染色的强度几乎接近了阳性对照的强度，而 在阴性对照中没有颜色变化。
[0048] 3.2GUS酶活检测
[0049] 将需要测定GUS酶活性的材料:叶片（来源于实例2的样品材料)约IOOmg置研钵中 加液氮研磨成粉末加入提取缓冲液500yL(50mM NaH2P〇4，pH 7.0，10mM EDTA，0.1%Triton X-100，0.1 (w/v)十二烷基磺酸钠，ΠΜΜβ-巯基乙醇），4°C离心，上清为⑶S蛋白提取液。用 BSA法测定蛋白浓度。取出部分加 GUS反应底物4-MUG，于37°C反应30min，在激发光365nm发 射光455nm的条件下进行荧光测定，3次生物学重复，最终以单位时间内产物的相对变化量 来计算GUS报告基因的酶活性值。图4-A显示的是重组质粒瞬时表达烟草检测GUS报告基因 酶活的结果表明，与未接种的样品相比，PMP3启动子能在接种后的2h驱动报告基因上调表 达5.18倍。
[0050] 3.3(^5 1111?熟的检测
[0051] 以实施例2方法2获得的材料为对象，采用实时荧光定量PCR的方法检测以检测GUS 报告基因转录水平的表达。将实施例2方法2获得的材料，置研钵中加液氮研磨成粉末，加入 试剂盒RNeasy kit(Tiangen)的相应试剂，提取总RNA。用iScript cDNA Synthesis kit (TaKaRa)反转录为cDNA，并定量到lOOngyl-1。用SYBR master mix(TaKaRa)试剂盒，在ABI 7500Real_time PCR system焚光定量仪上采用SYBR greenl焚光染料法进行qRT-PCR分析， 采用相对定量法分析基因的转录水平表达情况。实验设计3个生物学重复。
[0052] 用本氏烟的EFla(Genbank accession no.AF120093.1)作为烟草的内参基因，其 引物：
[0053] 上游引物EFla-QF:序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0054] 下游引物EFla-QR:序列如SEQ ID NO.2所示。
[0055] 检测⑶S转录水平表达用到的引物：
[0056] 上游引物mGUS-QF:序列如SEQIDN0·3所示；
[0057] 下游引物mGUS-QR:序列如SEQIDN0·4所示。
[0058]图4-B显示的是PMP3::⑶S重组质粒瞬时表达烟草检测⑶S报告基因转录水平的表 达，结果表明：人工合成的PMP3启动子在疫霉接种后的2h能够驱动GUS报告基因在转录水平 上调表达2.95倍。
[0059]用烟草瞬时表达系统，两种不同的检测⑶S报告基因活性的方法，最终验证了人工 合成的PMP3启动子能在疫霉诱导早期快速驱动其下游报告基因上调表达。由此可见，PMP3 启动子是疫霉诱导性启动子。本研究中所用到的引物见表1。
[0060]表1本研究中所用到的荧光定量引物
[0064]可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发 明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这 些改进和变更也属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种疫霉诱导性启动子，其特征在于:该启动子是以AAAGAC顺式元件及其上游9bp和 下游15bp的侧翼序列为核心序列。2. 根据权利要求1所述的疫霉诱导性启动子，其特征在于：上游的侧翼序列为 AATCAGATA，下游的侧翼序列为ATGCATATTAGTTGA。3. 根据权利要求1或2所述的疫霉诱导性启动子，其特征在于:该启动子包含有四个重 复的顺式元件AAAGAC，每个所述顺式元件AAAGAC的上游9bp和下游15bp的侧翼序列。4. 根据权利要求3所述的疫霉诱导性启动子，其特征在于：该启动子的序列如SEQ IDN0.5 所示。5. -种核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列中包含有权利要求1~4任意一项所述的 疫霉诱导性启动子的序列。6. 含有权利要求1~4任意一项所述的疫霉诱导性启动子的重组表达载体、转基因细胞 系和转基因重组菌。7. 根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是将权利要求1、 2、3或4所述的疫霉诱导性启动子的序列构建在植物表达载体的报告基因上游，所述的疫霉 诱导性启动子能够在疫霉菌的诱导下驱动报告基因的表达。8. 权利要求1~4任意一项所述的疫霉诱导性启动子在构建含有疫霉诱导性启动子的 重组表达载体和构建具有疫霉菌诱导表达的转基因植物中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的转基因植物为烟草。10. 权利要求5所述的核苷酸序列以及权利要求6或7所述的重组表达载体在构建具有 疫霉菌诱导表达的转基因植物中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK105861509SQ201610452615
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】窦道龙, 柴春月, 曾文韬
【申请人】南京农业大学