专利名称：一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，属微生物采油领域。
背景技术：
微生物产生物表面活性剂是微生物提高原油采收率的主要机理之一。微生物产生物表面活性剂主要有脂肽和糖脂两种。脂肽是迄今报道的效果最好的生物表面活性剂之一，由于其特殊的结构，可以帮助微生物细胞粘附于烃类物质表面进行解烃代谢，降低表面张力，在极端条件下仍能保持其活性，对微生物提高原油采收率技术具有极其重要的价值。目前产生物表面活性剂是微生物提高原油采收率有两种方法，一种叫地面法，即将微生物地面发酵生产生物表面活性剂注入油藏；另一种叫地下法，即将油藏的内源微生物或注入的外源微生物在地下发酵产生生物表面活性剂。但是，目前关于如何准确定量微生物驱油藏中产脂肽表面活性剂的微生物，尚无相关方法，主要通过测定排油圈大小和表面张力大小间接判断产表面活性剂微生物的多少。现有技术中，期刊《化学工程师》2005年第01期中的“排油圈法对生物表面活性剂的定性与定量”一文，介绍了一种利用排油圈直径与表面活性剂浓度之间都呈线性关系，通过测定排油圈直径大小定性分析产生物表面活性剂的微生物多少。期刊《化学与生物工程》2010年第27卷，第2期中的“一株产脂肽类生物表面活性剂菌株的分离及代谢产物分析” 一文，介绍了通过表面张力的测定对产生物表面活性剂的微生物进行定性分析。上述两篇文献分别利用排油圈直径的大小和表面张力的大小来表征生物表面活性剂的量，进而定性反映产表面活性剂的微生物多少，操作方法简单易行，但其缺点在于仅能定性判断产表活剂微生物的有无或多少，无法定量判断产表活剂微生物的量，且存在重复性差和准确性低的不足。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法。该方法可以快速的实现对微生物驱油藏中产脂肽类表面活性剂微生物的定量。本发明解决的技术问题方案是提供一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，其具体步骤如下
1、设计和合成引物
在GeneBank中搜索产脂肽类表面活性剂微生物的脂肽合成酶基因，对其同源性进行比较，选择基因的保守区序列，按照引物设计原则设计一对引物；
2、荧光定量PCR反应程序和反应体系的优化和建立
通过对Mg2+浓度、引物浓度和退火温度的选择，以最低Ct值(荧光定量PCR过程中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)和最高RFU (相对荧光强度值)为筛选指标，确定反应体系和反应程序；3、标准品质粒的制备
应用PCR技术从产脂肽微生物枯草芽孢杆菌中获得脂肽合成酶基因片段，与T载体连接，构建重组质粒，测定重组质粒A26tl (波长为260nm时的吸光度)计算质粒拷贝数，此计算出拷贝数的重组质粒即为实时定量PCR的标准品质粒；
4、建立标准曲线
取步骤3标准品质粒，以10倍的倍比关系进行梯度稀释，分别作为qPCR (实时荧光定量PCR)反应的模板进行扩增，以不同稀释梯度质粒拷贝数的对数值对相应的阈值循环数做图，制作标准曲线。5、方法灵敏度和稳定性考核
(1)方法灵敏度考核
将按10倍稀释，拷贝数为IXlO7 copies/μ I IX IO1 copies/μ I的标准品质粒做为模板，步骤2中的反应体系和反应程序分别进行检测，考察检测下限，对灵敏性进行评价；
(2)方法稳定性考核
分三天分别进行三次独立试验，每个浓度做三个平行，通过对实验结果Ct值的平均值和变异系数来评价方法的稳定性或可重复性。所述步骤I中的引物对序列为 srfAF 5’ -CAAAAKCGCAKCATACCACKTTGAG-3’ srfAR 5’ -TCA TAR AGC GGC AYA TAT TGA TGC-3’
所述步骤2中的反应体系设为20 μ 1，体系组成反应缓冲液为IOXTaq PCR buffer,Mg2+浓度为3. 5mM, dNTPs浓度为O. 2mM, Taq酶2. 5U,引物的浓度均为O. I μ M, 20 X SybrGreen I I μ I,模板 2 μ I,无菌水 7 μ I。所述步骤2中的PCR反应程序为(1)预变性95°C 5min，(2)荧光收集，95°C 15s58°C 15s 72°C 20s，每个循环结束后进行荧光信号收集，扩增40个循环，(3)溶解曲线分析，65°C逐步升至95°C，每隔O. 2°C收集一次荧光。所述步骤2中退火温度范围为55°C 65°C，Mg2+浓度范围为1μΜ、1. 5μΜ、2·5μΜ、3·5 μΜ、4·5 μ Μ、6 μ Μ，引物浓度范围为 O. I μ Μ、0. 2 μΜ,Ο. 4μΜ,0. 6μΜ.
O.8 μ Μ、I. O μ Μ。所述的一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，还包括微生物驱油藏样品的现场取样，其取样步骤为(I)采用带胶塞和螺旋盖的玻璃瓶，用去离子水清洗干净，用高纯氮气置换瓶内空气，用胶塞和盖子密封后，高压蒸汽121°c灭菌20min，(2)打开井口取样口阀门，用废液桶接取液体，使液体畅流15L 20L，(3)打开采样容器，连接取样口，待注入水充满采样容器，拧盖密封，(4)在采样容器上贴上标签，置于4°C条件下在4h内送回实验室进行分析。所述的一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，还包括所述的微生物驱油藏样品处理，样品处理步骤为(I)取含有高纯氮气的厌氧管中的油藏产出液样品，取Iml注入到经灭菌的I. 5 ml的离心管中，(2)在振荡器上充分振荡5 min, 13 000rpm离心I min ,从管中轻轻的弃上清液900 μ I, (3)在剩余的100 μ I中加入无菌生理盐水900 μ 1，在振荡器上充分振荡5 min, (4)13 000 rpm离心2 min，弃上清液980 μ 1，充分振荡2 min，所得20 μ I即为模板。
所述步骤3中标准品质粒的制备，具体方法如下
(I)脂肽合成酶基因片段的获取
从I ml产脂肽微生物枯草芽孢杆菌过夜培养物中提取总DNA，产脂肽微生物枯草芽孢杆菌培养基为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH值7. 3，通过紫外分光光度计和凝胶电泳确定DNA的纯度和浓度，以srfAF/ srfAR引物对进行实时定量PCR反应。反应体系及扩增程序如下
20 μ I体系反应缓冲液为IOXTaq PCR buffer, Mg2+浓度为3. 5mM, dNTPs浓度为
O.2mM, Taq酶2. 5U，引物的浓度均为O. ΙμΜ，模板3μ 1，无菌水7μ I。扩增程序①95°C变性 5min，② 95°C 30s 58°C 30s 72°C 45s，30 个循环，③ 72°CIOmin.·
通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，然后在紫外灯下切下目的基因条带，用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，即获得纯化的脂肽合成酶基因片段。(2)重组质粒的连接、转化、阳性克隆筛选及鉴定
将T载体与脂肽合成酶基因片段以摩尔比1:4比例进行连接，16°C连接反应lh，连接产物转化DH5 α感受态细胞，采用氨苄青霉素抗性LB琮脂糖平板初次筛选和菌落PCR再次筛选的方法确定阳性菌落，在氨苄青霉素抗性LB培养液中扩增阳性菌落，最后将菌液送去测序进行再次验证。(3)标准品模板的定量
提取经验证含有目的基因的重组质粒，通过紫外分光光度计测量质粒的A26tl的值，根据相对分子质量和阿伏伽德罗常数计算出分子拷贝数，将重组质粒稀释成不同倍数即为实时定量PCR反应的标准品质粒。本发明与现有技术相比具有以下优点
1、灵敏度和准确性高，特异性强；
2、操作简单，可重复性高；
3、检测时间段，从样品DNA的提取到上机检测出结果所需时间小于2h；
4、可以同时对多个样品实现高通量检测。
图I :微生物驱油藏产脂肽微生物定量灵敏性的扩增结果。从左到右依次为，IXlO7 copies/μ I, I X IO6 copies/ μ I, I X IO5 copies/ μ I, I X IO4 copies/ μ I, I X IO3copies/ μ I, I X IO2 copies/ μ I 和 I X IO1 copies/μ I。图2:微生物驱油藏产脂肽微生物检测的标准曲线。横坐标表示初始模板量的log值，纵坐标表示每个浓度样品的Ct值。图3 :微生物驱油藏产脂肽微生物重复三次的检测结果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步详细描述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的要求保护的范围。实施例I1、设计、合成引物
在GeneBank中搜索产脂肽类表面活性剂微生物的脂肽合成酶基因，对其同源性进行比较，选择基因的保守区序列，按照引物设计原则设计引物对，由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物对的序列是
srfAF 5’ -CAAAAKCGCAKCATACCACKTTGAG-3’srfAR 5’ -TCA TAR AGC GGC AYA TAT TGA TGC-3’
2、荧光定量PCR反应程序和反应体系的优化和建立
反应条件的优化主要包括Mg2+浓度、引物探针浓度比和退火温度的选择。在Real-TimePCR反应程序中，固定反应体系，调整不同的退火温度(55°C 65°C)，以相同浓 度产脂肽微生物枯草芽孢杆菌TH-2基因组DNA为模板进行检测，以最低Ct值和RFU为标准进行筛选，确定最佳退火温度。在最佳退火温度下，选用Mg2+浓度分别为1μΜ、1.5μΜ、
2.5μΜ、3. 5 μΜ、4. 5 μ Μ、6 μ Μ，在最佳引物探针浓度配比下，优选最佳Mg2+浓度。试验以相同浓度产脂肽微生物枯草芽孢杆菌ΤΗ-2基因组DNA为模板，在最佳Mg2+浓度下，引物浓度分别为 O. 1μΜ、0. 2 μΜ、0. 4μΜ、0. 6μΜ. O. 8 μ Μ、1.0 μ Μ，以最低 Ct 值和 RFU 为筛选指标，优选引物浓度。经优化后的反应体系和反应程序为
反应体系设为20 μ 1，体系组成反应缓冲液为IOXTaq PCR buffer, Mg2+浓度为
3.5mM，dNTPs浓度为 O. 2mM，Taq酶 2. 5U，引物的浓度均为 O. I μ M，20X Sybr Green I I μ I,模板2 μ 1，无菌水7 μ I。qPCR 反应程序为(1)预变性 95°C 5min，(2)荧光收集，95 °C 15s 58 °C 15s72°C 20s，每个循环结束后进行荧光信号收集，扩增40个循环，(3)溶解曲线分析，65°C逐步升至95°C，每隔O. 2°C收集一次荧光。3、标准品质粒的制备
应用PCR技术从产脂肽微生物枯草芽孢杆菌基因组DNA中获得脂肽合成酶基因，与T载体连接，构建重组质粒，作为实时定量PCR的标准品，具体方法如下
(I)脂肽合成酶基因片段的获得
从I ml产脂肽微生物枯草芽孢杆菌过夜培养物中提取总DNA，通过紫外分光光度计和凝胶电泳确定DNA的纯度和浓度。以srfAF/ srfAR引物对进行实时定量PCR反应。反应体系及扩增程序如下
20 μ I体系反应缓冲液为IOXTaq PCR buffer, Mg2+浓度为3. 5mM, dNTPs浓度为O. 2mM, Taq酶2. 5U，引物的浓度均为O. I μ M，模板3μ 1，双蒸水补齐。扩增程序95°C变性5min ;95°C 30s 58°C 30s 72°C 45s 30个循环，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，然后在紫外灯下切下目的基因条带，用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，即获得纯化的脂肽合成酶基因片段。(2)重组质粒的连接、转化、阳性克隆筛选及鉴定
将T载体与srfA基因片段以I :4的摩尔比进行连接，16°C连接反应时间为lh。连接产物转化DH5 α感受态细胞，采用氨苄青霉素抗性LB琼脂平板初次筛选和菌落PCR再次筛选的方法确定阳性菌落，在氨苄青霉素抗性LB培养液中扩增阳性菌落，最后将菌液送去测序进行最终验证。(3)标准品质粒的定量
提取经验证含有脂肽合成酶基因的重组质粒，通过紫外分光光度计测量质粒的A26tl的值，根据相对分子质量和阿伏伽德罗常数计算出质粒拷贝数，将重组质粒以10倍稀释成不同浓度即为实时定量PCR反应的标准品质粒。4、建立标准曲线
取步骤3标准品质粒，以10倍的倍比关系进行梯度稀释，分别作为qPCR反应的模板进行扩增，以不同稀释梯度质粒拷贝数的对数值对相应的阈值循环数做图，制作标准曲线。结果显示，本发明的方法在IXlO7 copies/μ I IXlO1 copies/μ I范围内，标准曲线呈良好的线性关系，R2= O. 998，扩增效率Ε=99. 6%。
5、方法稳定性和灵敏度考核 (O方法灵敏度考核
将按10倍稀释，拷贝数为I X IO7 copies/ μ I I X IO1 copies/ μ I的标准品质粒做为模板，用本发明的荧光定量PCR检测体系分别进行检测，考察检测下限，对灵敏性进行评价。(2)方法稳定性考核
分三天分别进行三次独立试验，每个浓度做三个平行，通过对实验结果Ct值的平均值和变异系数来评价方法的稳定性或可重复性。表I油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法稳定性检测
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表2油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法日间变异系数
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本方法能够检测的质粒拷贝数最低为lOcopies/μ 1，具有较高的检测灵敏性。对6种不同浓度的菌液重复检测3次，扩增得到的Ct值见表1，Ct值变异系数在合理范围内(最大为I. 31%，均小于5%)。分三天分别进行三次独立试验结果见表2，变异系数均小于5%，在浓度IO4 copies/μ I IO5 copies/μ I时重复性比较好，此浓度范围时本方法稳定性稳定性最好。实施例2 :微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法与传统的测定排油圈和表面张力方法分析油藏产脂肽微生物的比较
分别取胜利油田某区块6 口油井产出液，经相应的处理后，分别进行排油圈法测试，表面张力测试和产脂肽微生物定量分析。
权利要求
1.一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，包括以下具体实施步骤 (1)、设计和合成引物 在GeneBank中搜索产脂肽类表面活性剂微生物的脂肽合成酶基因，对其同源性进行比较，选择基因的保守区序列，按照引物设计原则设计一对引物； (2)、荧光定量PCR反应程序和反应体系的优化和建立 通过对Mg2+浓度、引物浓度和退火温度的选择，以最低Ct值和最高RFU为筛选指标，确定反应体系和反应程序； (3)、标准品质粒的制备 应用PCR技术从产脂肽微生物枯草芽孢杆菌中获得脂肽合成酶基因片段，与T载体连接，构建重组质粒，测定重组质SA26tl计算质粒拷贝数，此计算出拷贝数的重组质粒即为实时定量PCR的标准品质粒； (4)、建立标准曲线 取步骤(3)标准品质粒，以10倍的倍比关系进行梯度稀释，分别作为qPCR (实时荧光定量PCR)反应的模板进行扩增，以不同稀释梯度质粒拷贝数的对数值对相应的阈值循环数做图，制作标准曲线； (5 )、方法灵敏度和稳定性考核 ①方法灵敏度考核 将按10倍稀释，拷贝数为I X IO7 copies/ μ I I X IO1 copies/ μ I的标准品质粒做为模板，步骤(2)中的反应体系和反应程序分别进行检测，考察检测下限，对灵敏性进行评价； ②方法稳定性考核 分三天分别进行三次独立试验，每个浓度做三个平行，通过对实验结果Ct值的平均值和变异系数来评价方法的稳定性或可重复性； 其特征在于，所述步骤(I)中的引物对序列为srfAF 5’ -CAAAAKCGCAKCATACCACKTTGAG-3’srfAR 5’ -TCA TAR AGC GGC AYA TAT TGA TGC-3’ 所述步骤(2)中的反应体系设为20 μ 1，体系组成反应缓冲液为IOXTaq PCRbuffer, Mg2+浓度为3. 5mM, dNTPs浓度为O. 2mM, Taq酶2. 5U,引物的浓度均为O. I μ M,20X Sybr Green I I μ I,模板 2 μ I,无菌水 7 μ I ; 所述步骤(2)中的PCR反应程序为①预变性95°C 5min，②荧光收集，95°C15s58°C 15s 72°C 20s，每个循环结束后进行荧光信号收集，扩增40个循环，③溶解曲线分析，65°C逐步升至95°C，每隔O. 2°C收集一次荧光。
2.根据权利要求I所述的一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，其特征在于，所述具体实施步骤还包括微生物驱油藏样品的现场取样，取样步骤为 (1)采用带胶塞和螺旋盖的玻璃瓶，用去离子水清洗干净，用高纯氮气置换瓶内空气，用胶塞和盖子密封后，高压蒸汽121°C灭菌20min ； (2)打开井口取样口阀门，用废液桶接取液体，使液体畅流15L 20L； (3)打开采样容器，连接取样口，待注入水充满采样容器，拧盖密封；(4)在采样容器上贴上标签，置于4°C条件下在4h内送回实验室进行分析。
3.根据权利要求I或2所述的一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，其特征在于，所述具体实施步骤还包括微生物驱油藏样品处理，样品处理步骤为 (1)取含有高纯氮气的厌氧管中的油藏产出液样品，取Iml注入到经灭菌的I.5 ml的离心管中； (2)在振荡器上充分振荡5min, 13 OOO rpm离心I min ,从管中轻轻的弃上清液900μ I ; (3)在剩余的100μ I中加入无菌生理盐水900 μ I，在振荡器上充分振荡5 min ; (4)13 000 rpm离心2 min,弃上清液980 μ 1，充分振荡2 min,所得20 μ I即为 模板。
4.根据权利要求I所述的一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，其特征在于，所述步骤(2)中退火温度范围为55°C 65°C，Mg2+浓度范围为1μΜ、1. 5μΜ、2·5μΜ、3·5 μΜ、4·5 μ Μ、6 μ Μ，引物浓度范围为 O. I μ Μ、0. 2 μΜ,Ο. 4μΜ,0. 6μΜ.O.8 μ Μ、I. O μ Μ。
5.根据权利要求I所述的一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，其特征在于，所述步骤(3)中标准品质粒的制备，具体制备方法如下 (1)脂肽合成酶基因片段的获取 从I ml产脂肽微生物枯草芽孢杆菌过夜培养物中提取总DNA，通过紫外分光光度计和凝胶电泳确定DNA的纯度和浓度，以srfAF/ srfAR引物对进行实时定量PCR反应； 20 μ I体系反应缓冲液为IOXTaq PCR buffer, Mg2+浓度为3. 5mM, dNTPs浓度为O. 2mM, Taq酶2. 5U，引物的浓度均为O. ΙμΜ，模板:3μ 1，无菌水7μ I ； 扩增程序① 95°C 变性 5min，② 95°C 30s 58 °C 30s 72 °C 45s，30 个循环，③ 72 °CIOmin ； 通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，然后在紫外灯下切下目的基因条带，用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，即获得纯化的脂肽合成酶基因片段； (2)重组质粒的连接、转化、阳性克隆筛选及鉴定 将T载体与脂肽合成酶基因片段以摩尔比1:4比例进行连接，16°C连接反应lh，连接产物转化DH5 α感受态细胞，采用氨苄青霉素抗性LB琮脂糖平板初次筛选和菌落PCR再次筛选的方法确定阳性菌落，在氨苄青霉素抗性LB培养液中扩增阳性菌落，最后将菌液送去测序进行再次验证； (3)标准品模板的定量 提取经验证含有目的基因的重组质粒，通过紫外分光光度计测量质粒的A26tl的值，根据相对分子质量和阿伏伽德罗常数计算出分子拷贝数，将重组质粒稀释成不同倍数即为实时定量PCR反应的标准品质粒。
6.根据权利要求5所述的一种微生物驱油藏产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，其特征在于，所述的产脂肽微生物枯草芽孢杆菌培养基为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠 10g/L，pH 值 7.3。
全文摘要
本发明涉及一种微生物驱油藏内源产脂肽类表面活性剂微生物的定量方法，针对产脂肽类表面活性剂微生物脂肽合成酶基因设计引物，进行荧光定量PCR。在优化的反应程序和反应体系下，以从标准产脂肽菌株中获得的脂肽合成酶基因与载体连接，构建重组质粒，作为实时定量PCR的标准品，将此标准品进行10倍梯度稀释作为模板进行荧光定量PCR绘制标准曲线，将微生物驱油藏样品经简单处理作为模板进行荧光定量PCR，根据线性关系R2和扩增效率E来衡量重复样品数据是否一致和不同拷贝数的初始模板是否具有相同的扩增效率。本发明使用脂肽合成酶特异引物在优化的反应条件下检测油藏产脂肽类表面活性剂微生物时，具有更高的稳定性和灵敏性，可广泛应用于微生物采油提高采收率领域。
文档编号C12Q1/64GK102925563SQ20121039834
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者张绍东, 郝滨, 宋永亭, 郭辽原, 高光军, 宋智勇, 刘涛, 李彩风, 曹功泽, 吴晓玲 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司胜利油田分公司采油工艺研究院