专利名称：用于检测mll相关融合基因的多重实时定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测MLL相关融合基因的多重实时定量PCR试剂盒。
背景技术：
混合系白血病(mixed lineage leukemia, MLL)基因位于染色体llq23上，涉及llq23的染色体易位形成的MLL相关融合基因见于白血病，其与白血病的发生相关。MLL相关融合基因(+ )的白血病具有以下特点(I)不具有类型特异性，既见于急性淋巴细胞白血病(ALL)又见于急性髓性白血病(AML)，在ALL及AML的发生率均不超过10%，不过超过70%的婴儿ALL具有MLL融合基因，因此无论是ALL还是AML均需要筛查MLL融合基因；(2 )伙伴基因众多，目前已发现其伙伴基因超过50种，因此采用单一的PCR逐一检测各种类型的MLL 融合基因费力、耗时，不具有临床应用价值。尽管伙伴基因众多但是发生率差异很大，其中最常见的前六种伙伴基因分别是AF4 (位于染色体4q21)、AF9 (位于染色体9p22)、ENL (位于染色体19pl3. 3)、AF10 (位于染色体10pl2)、AF6 (位于染色体6q27)和ELL (位于染色体19pl3. I)，这六种的发生率占到了全部MLL相关融合基因的85-90% ；(3)总体预后很差，除了其中的MLL-AF9型在2008版的WHO白血病诊断标准中被列为中度预后，其它类型均预示预后很差。因此临床上很有必要尽快确定是否具有MLL相关融合基因以及其伙伴基因，以指导临床选择合适的治疗方案，尽早开始治疗。多重PCR的原理是在一个PCR反应管中含有针对多种融合基因的多对引物，通过优化反应条件来保证扩增的特异性和灵敏度，一旦有阳性扩增条带再通过分管分别扩增来最终确定融合基因类型。因此这种PCR尤其适合分布广泛但发生率不高的多个基因的同时筛查，既省力、省时又经济。而MLL融合基因正好符合这个特点，因此采用多重PCR适于对白血病患者进行MLL相关融合基因的初筛。基于TaqMan探针的实时定量PCR (RQ-PCR)在过去的十年里得到了广泛的推广和应用，它与普通PCR相比，除了实现了真正意义的定量之外还具有以下优点(I)特异性增强、灵敏度提高；(2)扩增过程中闭管操作，实时收集数据，降低了污染机会，减少假阳性结果；(3)无需电泳，缩短了操作时间；(4)通过定量内参基因来评价样本质量，减少了假阴性结果。如果基于TaqMan探针的RQ-PCR与多重PCR相结合，就能兼具多重PCR和RQ-PCR的优点，在多重PCR基础上既增加了特异性和敏感性，又更加快速简单，因此是很具有临床应用价值的MLL相关融合基因检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测MLL相关融合基因mRNA的实时定量PCR试剂盒，所述试剂盒中含有用于实时定量PCR检测MLL相关融合基因mRNA的上游引物I、下游引物I和TaqMan探针I ;所述上游引物I由序列表序列1、2和3所示的三种单链DNA组成，分别位于MLL基因外显子7、9和8上；所述TaqMan探针I由序列表序列19、20和21所示的三种单链DNA组成，分别位于MLL基因外显子7、9和8上；所述下游引物I由如下I) —6)下游引物组合中的六种、任意五种、任意四种、任意二种、任意两种或任一种组成I)由序列表序列4、5和6所示的三种单链DNA组成，分别位于AF4基因外显子7和8、5和6上；2)由序列表序列7和8所示的两种单链DNA组成，分别位于AF6基因外显子3和2上；3)由序列表序列9、10、11和12所示的四种单链DNA组成，分别位于AF9基因外显 子11、6、5和9上；4)由序列表序列13、14和15所示的三种单链DNA组成,分别位于AFlO基因外显子8和9、20和12上；5)由序列表序列16所示的单链DNA组成,位于ELL基因外显子2上；6)由序列表序列17和18所示的两种单链DNA组成，分别位于ENL基因外显子7和2上。在上述试剂盒中，还可含有实时定量PCR检测内参基因ABL mRNA的上游引物II、下游引物II和TaqMan探针II ;所述上游引物II为序列表序列22所示的单链DNA ;所述下游引物II为序列表序列23所示的单链DNA ;所述TaqMan探针II的核苷酸序列如序列表序列24所示。在上述试剂盒中，所述TaqMan探针I和II的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。在上述试剂盒中，还可含有独立包装的荧光PCR的Master Mix。在上述试剂盒中，还可含有阳性对照和/或阴性对照；所述阴性对照为来源于健康人外周血单个核细胞的cDNA ；所述阳性对照为来源于MLL/AF4型白血病患者外周血单个核细胞的cDNA，和/或来源于MLL/AF6型白血病患者外周血单个核细胞的cDNA，和/或来源于MLL/AF9型白血病患者外周血单个核细胞的cDNA，和/或来源于MLL/AF10型白血病患者外周血单个核细胞的cDNA，和/或来源于MLL/ENL型白血病患者外周血单个核细胞的cDNA，和/或来源于MLL/ELL型白血病患者外周血单个核细胞的cDNA;所述MLL/AF4型白血病患者为llq23染色体发生易位后形成的融合基因中包含了MLL和AF4基因的部分或全部；所述MLL/AF6型白血病患者为llq23染色体发生易位后形成的融合基因中包含了MLL和AF6基因的部分或全部；所述MLL/AF9型白血病患者为llq23染色体发生易位后形成的融合基因中包含了MLL和AF9基因的部分或全部；所述MLL/AF10型白血病患者为llq23染色体发生易位后形成的融合基因中包含了 MLL和AFlO基因的部分或全部；所述MLL/ENL型白血病患者为llq23染色体发生易位后形成的融合基因中包含了MLL和ENL基因的部分或全部；所述MLL/ELL型白血病患者为llq23染色体发生易位后形成的融合基因中包含了MLL和ELL基因的部分或全部。本发明所提供的试剂盒具有以下优点I、覆盖 面广本试剂盒包含最常见的六种MLL相关融合基因，覆盖了 85%的全部MLL相关融合基因。2、准确可靠本试剂盒采用的是基于TaqMan探针的RQ-PCR,保证了扩增的特异性；此外，在利用多重RQ-PCR体系检测到阳性结果后，进一步分管操作分别检测，来确定融合基因类型，同时起到对多重结果的验证作用。3、操作简便、省时，成本低采用一管多重RQ-PCR体系同时筛查最常见的6种MLL相关融合基因，若为阴性，无需再分管操作，即可获得最终结果；扩增结束即可知道结果，无需电泳过程；此外,实验体系仅为10 μ 1，亦降低了成本。本发明所提供的试剂盒可用于急性白血病患者MLL相关融合基因的快速准确筛查，为帮助临床疾病的确诊、治疗方案的确定、寻找用于疗效评价的特异性分子标志及预后提供了重要的依据。
图I为利用实施例I试剂盒检测9例来自不同患者的待测样品扩增产物的测序及比对结果。其中，A-I分别代表9例来自不同患者的结果。图2为利用实施例I试剂盒检测I号患者cDNA样品的结果。其中，a图为扩增体系I的结果，b图为扩增体系I -I的结果。图3为利用实施例I试剂盒的扩增体系I检测3号患者cDNA样品的灵敏度。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。突光PCR的Master mix :购自美国ABI公司。实施例I、检测MLL相关融合基因的多重实时定量PCR试剂盒一、MLL相关融合基因的实时定量PCR (RQ-PCR)扩增体系I、多重MLL相关融合基因的实时定量PCR (RQ-PCR)扩增体系I组成I)上游引物I :3条位于MLL基因上的引物1、2及3，反应终浓度各为0.3μΜ;2)下游引物I :15条分别位于六个伙伴基因上的引物4一 18，反应终浓度各为O. 3μΜ ；3) TaqMan探针I :3条位于MLL基因上的TaqMan探针19一21，反应终浓度各为O. 2μΜ ；4)突光 PCR 的 Master mix。2、MLL-AF4融合基因的RQ-PCR扩增体系I -I组成I)上游引物I :3条位于MLL基因上的引物1、2及3，反应终浓度各为0.3μΜ;2)下游引物I -I :3条位于AF4基因上的引物4一 6，反应终浓度各为O. 3μΜ ;
3) TaqMan探针I :3条位于MLL基因上的TaqMan探针19一21，反应终浓度各为O. 2μΜ ；4)突光 PCR 的 Master mix。3、MLL-AF6融合基因的RQ-PCR扩增体系I _2组成I)上游引物I :3条位于MLL基因上的引物1、2及3，反应终浓度各为0.3μΜ;2)下游引物I -2 2条位于AF6基因上的引物7和8，反应终浓度各为O. 3 μ M ;3) TaqMan探针I :3条位于MLL基因上的TaqMan探针19一21，反应终浓度各为O. 2μΜ ；
4)突光 PCR 的 Master mix。4、MLL-AF9融合基因的RQ-PCR扩增体系I _3组成I)上游引物I :3条位于MLL基因上的引物1、2及3，反应终浓度各为0.3μΜ;2)下游引物I -3 :4条位于AF9基因上的引物9—12，反应终浓度各为O. 3μΜ;3) TaqMan探针I :3条位于MLL基因上的TaqMan探针19一21，反应终浓度各为O. 2μΜ ；4)突光 PCR 的 Master mix。5、MLL-AFlO融合基因的RQ-PCR扩增体系I _4组成I)上游引物I :3条位于MLL基因上的引物1、2及3，反应终浓度各为O. 3μΜ;2)下游引物I -4:3条位于AFlO基因上的引物13-15，反应终浓度各为O. 3μ M ;3)TaqMan探针I :3条位于MLL基因上的TaqMan探针19_21，反应终浓度各为O. 2μΜ ；4)突光 PCR 的 Master mix。6、MLL-ELL融合基因的RQ-PCR扩增体系I _5组成I)上游引物I :3条位于MLL基因上的引物1、2及3，反应终浓度各为O. 3μΜ;2)下游引物I -5:1条位于AFlO基因上的引物16，反应终浓度各为O. 3μ M ;3) TaqMan探针I :3条位于MLL基因上的TaqMan探针19一21，反应终浓度各为O. 2μΜ ；4)突光 PCR 的 Master mix。7、MLL-ENL融合基因的RQ-PCR扩增体系I _6组成I)上游引物I :3条位于MLL基因上的引物1、2及3，反应终浓度各为0.3μΜ;2)下游引物I -6 :2条位于ENL基因上的引物17和18，反应终浓度各为O. 3μ M ;3) TaqMan探针I :3条位于MLL基因上的TaqMan探针19一21，反应终浓度各为O. 2μΜ ；4)突光 PCR 的 Master mix。上述引物1-18及探针19-21的序列如表I所示。表I. MLL相关融合基因RQ-PCR扩增的引物及探针序列
引物I名称 I序列(5’ -3’)WmM~[S
IMLLFl CGCCTCAGCCACCTACTACAG 序列 I MLL 的外显子 7 上
权利要求
1.用于检测MLL相关融合基因mRNA的实时定量PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有用于实时定量PCR检测MLL相关融合基因mRNA的上游引物I、下游引物I和TaqMan探针I ; 所述上游引物I由序列表序列1、2和3所示的三种单链DNA组成； 所述TaqMan探针I由序列表序列19、20和21所示的三种单链DNA组成； 所述下游引物I由如下I) —6)下游引物组合中的六种、任意五种、任意四种、任意三种、任意两种或任一种组成 O由序列表序列4、5和6所示的三种单链DNA组成； 2)由序列表序列7和8所示的两种单链DNA组成； 3)由序列表序列9、10、11和12所示的四种单链DNA组成； 4)由序列表序列13、14和15所示的三种单链DNA组成； 5)由序列表序列16所示的单链DNA组成； 6)由序列表序列17和18所示的两种单链DNA组成。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有实时定量PCR检测内参基因ABL mRNA的上游引物II、下游引物II和TaqMan探针II ; 所述上游引物II为序列表序列22所示的单链DNA ;所述下游引物II为序列表序列23所示的单链DNA ;所述TaqMan探针II的核苷酸序列如序列表序列24所示。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述TaqMan探针I和II的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂或试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有独立包装的荧光PCR的Master Mix。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂或试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有阳性对照和/或阴性对照。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测MLL相关融合基因的多重实时定量PCR试剂盒。该试剂盒中含有由序列表序列1、2和3所示的三种单链DNA组成的上游引物，由序列表序列19、20和21所示的三种单链DNA组成的TaqMan探针和由序列表序列4—18所示的十六种单链DNA组成的下游引物。本发明所提供的试剂盒可检测最常见的六种MLL相关融合基因，检测结果准确可靠，操作简便、省时，成本低；可用于急性白血病患者MLL相关融合基因的快速准确筛查，为帮助临床疾病的确诊、治疗方案的确定、寻找用于疗效评价的特异性分子标志及预后提供了重要的依据。
文档编号C12Q1/68GK102876799SQ201210397680
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月18日 优先权日2012年10月18日
发明者秦亚溱, 刘艳荣, 李金兰, 主鸿鹄, 李玲娣, 赖悦云, 黄晓军 申请人:北京大学人民医院