专利名称：甘蔗黄锈病菌pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种甘蔗病原菌的检测方法，具体涉及甘蔗黄锈病菌PCR检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
甘鹿黄锈病(Sugarcane orange rust disease)属真菌性病害，由属于屈恩柄锈菌的甘鹿黄锈病菌引起。病原菌可经由风快速传播,然后通过气孔侵入，造成感病品种蔗茎产量和蔗糖分的损失。与甘蔗褐锈病不同，甘蔗黄锈病在春季更流行，适宜的环境条件更利于病害发展，例如温暖湿润的夏季和凉爽的秋季。甘蔗黄锈病主要危害甘蔗叶片，在叶片上产生淡黄色小斑点，后病斑在叶片正背
两面产生长2 10 ram的橙黄色夏孢子堆，因此称为黄锈病。危害症状最初较轻，病斑不明显，随病斑扩大，拉长的黄色病斑留下浅黄绿色晕圈，且颜色由桔色发展到橙棕色。与一般的褐锈病不同，桔色锈斑从来不会发展为暗褐色。锈病脓包在叶表成团发生，且大多发生在低层叶片表面，病斑多在叶片基部。控制甘蔗黄锈病发生的首要措施为培育和栽种抗黄锈病甘蔗品种，在此过程中，如何检测目标甘蔗品种中是否含有甘蔗黄锈病菌以及检测的的效率和准确性与甘蔗抗黄锈病育种的进程和效果密切相关。目前，一般采取两种方法判断种茎是否带菌一种是采用分离培养技术，在建立纯培养物的基础上，根据培养物所产生孢子的形态特征进行鉴定，屈恩柄锈菌夏孢堆叶背生，长0.5 I _，表皮破裂时散出肉桂色粉状物。夏孢子卵圆形，表面具刺，浅黄色，大小25 42X17 25 ( μ m)，壁厚I. 5 2.5 μ m，赤道上有4个芽孔。冬孢子堆黑色，冬孢子长椭圆形，顶端圆或平，深褐色，大小30 56X15 22 ( μ m),壁厚2 4. 5 μ m,具一隔膜，柄短，黄褐色；另一种是基于该病害表型症状，因为甘蔗受黄锈病菌侵染后，病害症状表现为黄色病斑，拉长的病斑留下浅黄绿色晕圈，且颜色由桔色发展到橙棕色，且桔色锈斑从来不会发展为暗褐色，因此，可以采用种茎种植后，观察是否发生甘蔗黄锈病判断待检测甘蔗品种是否含有黄锈病菌。但是，上述的第一种方法由于分离培养以及最终建立纯培养物需要时间长，加上分离过程杂菌污染等，都会影响分离效果，检出效率不高；第二种方法则由于甘蔗、环境条件和病原菌三者之间的互作，可能导致即使种茎中存在该病原，病害也不一定会发生的现象，只有三个因素都具备，病害才能发生，因此，田间基于诱发的抗病性鉴定方法，鉴定结果难以预料，而且还存在不同地点、不同年份间的鉴定结果有较大的差异以及耗时长达几个月等逆势。显然，目前已有的技术方法，对于判断种茎是否带菌是不适用的，急需建立一种能够实现“快速”与“准确”目标要求的甘蔗黄锈病菌的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蔗黄锈病菌PCR检测方法，可用于田间甘蔗黄锈病菌的早期诊断及检测。本发明的甘蔗黄锈病菌PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于
1、PCR检测体系的建立PCR扩增体系为总体积25μ 1，内含2. 5 μ I IOXPCR缓冲液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP，10 μ mol/L 的检测引物 PCR-F和 PCR-R 各 I. O μ 1，I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因组 DNA，ddH20 补足到 25μ I ； PCR 扩增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min, 56 °C 45 S，72 °C I min，35 个循环；72 °C 8 min ;所述 10XPCR缓冲液组成成分为 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl 和 15 mmol/L MgCl2 ；
所述检测引物如下
PCR-F :5’-CACATCAAGGAAGGTGTTACCT-3'，
PCR-R :5’-GAGCCACAATTAAGTGCACTCT-3’ ；
2、PCR扩增产物的检测琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为525bp的位置出现DNA条带，为甘蔗黄锈病菌存在的标志。本发明的应用效果
本发明的甘蔗黄锈病菌PCR检测方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有实用性好、准确性高和操作简便快速等优点。I、实用性好直接从待检测甘蔗品种中检测甘蔗黄锈病菌具有重要的实际应用价值。目前，在甘蔗品种及其种质资源交换过程中，甘蔗黄锈病菌的检测方法是根据病菌培养物所产生孢子的形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定，无法满足快速检疫的需要。为了使我们的检疫方法具有实际的应用价值，我们采用直接从待检测甘蔗品种中提取DNA后直接进行PCR扩增，可在5 6小时内完成对甘蔗黄锈病菌的检测。因此本方法大大提闻了检测的效率。2、准确性高传统的甘蔗黄锈病菌检测技术是根据病原物孢子的形态特征或者根据田间种植后病害表型症状鉴定来确定检疫对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相似种或容易受环境条件的影响，从而导致准确性不高；同时，形态学检测在近缘菌内的不同种之间可区别的特征较少，有些甚至没有什么差异，同时还需要判断者具有丰富的知识和经验，方可作出准确的判断。而本发明根据甘蔗黄锈病菌的特异性序列，选择甘蔗黄锈病菌特有的一段保守序列设计特异引物，根据变异序列设计特异性引物进行扩增比较，为病原菌的检测和鉴定提供准确的靶标位点。经过与甘蔗黄锈病菌以及其它不同植物中近缘病原菌的比较，该引物的准确率高。3、操作简便快速应用本发明方法，提取待检测植株DNA、PCR扩增和常规琼脂糖凝胶电泳即可判定检测结果，无须对病原菌进行培养或田间种植鉴定，一般检测过程可在5 6小时完成。本发明为甘蔗黄锈病菌的鉴定，提供了高灵敏度的快速检测体系，可用于田间甘蔗黄锈病菌的早期诊断及检测，对我国抗黄锈病甘蔗育种和抗黄锈病甘蔗种质资源的保护具有重要的意义。
图I为使用甘蔗PCR-F和PCR-R检测引物鉴定6个待检测甘蔗品种是否受甘蔗黄锈病菌侵染(即是否含有甘蔗黄锈病菌)的PCR扩增图谱。其中各泳道中，M代表分子量标准；(代表以水作为模板的空白对照；P代表对应甘蔗品种中含有甘蔗黄锈病菌#代表对应甘蔗品种中不含甘蔗黄锈病菌；1_6代表6个甘蔗品种。
具体实施例方式为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。实施例I甘蔗黄锈病菌PCR检测方法 甘蔗黄锈病菌PCR检测方法，包括以下步骤
I、基因组DNA的提取
(1)取5克待检测甘蔗植株的叶片组织，置研钵，加入液氮磨碎成粉末，并在解冻前转入50 ml的离心管中；
(2)加入15ml,65 °C预热的SDS提取液，混匀后在65 1水浴保温40 min ；
(3)加8 ml 3 mol/L KAC 混匀后，冰浴 30 min ；
(4)25000 g，4 °C离心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4 1预冷的异丙醇；
(5)-20°C放置30 min后，钩出漂浮在液面的DNA，置于一干净的I. 5 ml离心管中，晾干后加入750 μ I TE溶液；加等体积的平衡饱和酚，摇匀，12000 g，4 °C离心，10 min ；
(6)转移上清至另一干净的I.5 ml离心管中，加等体积的氯仿，12000 g，4 °C，离心10min后移出上层水相；
(7)在水相中加2倍体积的无水乙醇，12000g，4 °C离心10 min，留沉淀，用体积浓度为70 %的乙醇清洗2次，并晾干；
(8)加灭菌后的TE溶液200μ I溶解后，置-20 °C冰箱中保存备用。2、PCR检测体系的建立
PCR扩增体系为总体积25 μ 1，内含2. 5 μ I 10XPCR缓冲液，2. 5 μ I 25 mmol/LMgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP，10 μ mol/L 的检测引物 PCR-F 和 PCR-R各 I. 0 μ I, I. 25U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng待检测甘蔗品种基因组DNA，ddH20补足到25 μ I。PCR扩增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min, 56 °C 45 s，72 °C I min，35 个循环；72 0C 8 min。
所述检测引物PCR-F和PCR-R，是采用ITS-PCR技术，经过大量的筛选试验，获得了甘蔗黄锈病菌的特异DNA片段，以此片段的DNA序列为基础，设计甘蔗黄锈病菌检测引物。所述检测引物PCR-F和PCR-R具体如下
PCR-F :5’-CACATCAAGGAAGGTGTTACCT-3'，
PCR-R :5’-GAGCCACAATTAAGTGCACTCT-3’。3、PCR扩增产物的检测
具体的检测方法为，取PCR扩增产物10 μ I，加5 μ I含有溴酚蓝的上样缓冲液，混匀后点样于含有0. 5 μ g/ml溴化乙锭的I. 5 %琼脂糖凝胶上，于0. 5 X TBE缓冲液中，10 V/cm恒定电压下电泳1.5 h，结束后在凝胶成像系统上成像并进行凝胶分析。PCR产物的检测结果采用检测引物PCR-F和PCR-R对待检测甘蔗品种的基因组DNA进行PCR扩增，结果如图I所示，受甘蔗黄锈病菌侵染(即含有甘蔗黄锈病菌)的样品出现525 bp的DNA条带，而没有受到甘蔗黄锈病菌侵染(即不含甘蔗黄锈病菌)的样品则不出现525 bp的DNA条带。我们取6个待检测甘蔗品种用PCR检测和病原菌分离培养后的形态特征判别方法鉴定的结果进行比较，结果是一致的。如图I所示，出现分子量为525 bp的DNA条带的样品所代表的甘蔗品种，经病原菌培养后的孢子形态特征鉴定均含甘蔗黄锈病菌；未出现分子量为525 bp的DNA条带的样品所代表的甘蔗品种，经病原菌培养后的孢子形态特征鉴定结果显示均不含甘蔗黄锈病菌。本发明采用的主要试剂如下(所有化学试剂均为分析纯)
1、SDS提取液NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 I. 44 g、KH2 PO4 0. 24 g、SDS 2 g、甘油50 ml,灭菌去离子I L, pH值7· 4 ;
2、TE溶液10 mmol/L Tris-HCl, I mmol/L EDTA ；
3、上样缓冲液0.I %溴酚蓝，40 %蔗糖；
4、0.5 X TBE 缓冲液44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3,1 mmol/L EDTA ；
5、PCR扩增试剂购自大连宝生物公司。本发明所使用的仪器主要如下
1、PCR扩增仪德国Eppendorf5331 PCR扩增仪；
2、电泳仪北京六一仪器厂DYCZ-20ADNA序列分析电泳仪；
3、离心机德国Eppendorf5810/5810R多功能台式离心机；
4、凝胶成像系统美国BIO-RADGel Doc 2000凝胶成像系统。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.一种甘蔗黄锈病菌的PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测，其特征在于 (1)PCR检测体系的建立PCR扩增体系为总体积25 μ 1，内含2. 5 μ I IOXPCR缓冲液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 μ mol/L 的检测引物 PCR-F和 PCR-R 各 I. O μ 1，I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-30 ng 基因组 DNA，ddH20 补足到 25μ I ； PCR 扩增程序如下94 0C 4 min ；94 °C I min，56 °C 45 s，72 °C I min，35 个循环；72 °C 8 min ;所述 10XPCR缓冲液组成成分为 100 mmol/L pH8. 5 Tris_HCl，500 mmol/L KCl和15 mmol/L MgCl2 ;所述检测引物如下PCR-F :5’-CACATCAAGGAAGGTGTTACCT-3'，PCR-R :5’-GAGCCACAATTAAGTGCACTCT-3’ ； (2)PCR扩增产物的检测琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为525bp的位置出现DNA条带，为甘蔗黄锈病菌存在的标志。
全文摘要
本发明涉及一种甘蔗黄锈病菌的PCR检测方法，包括基因组DNA的提取、PCR检测体系建立和PCR扩增产物的检测。本发明的甘蔗黄锈病菌PCR检测方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少的特点；与常规的根据病菌培养后的孢子形态特征鉴定或根据田间种植后病害表型症状鉴定的方法相比，具有实用性好、准确性高和操作简便快速等优点。为甘蔗黄锈病菌的鉴定，提供了高灵敏度的快速检测体系，可用于田间甘蔗黄锈病菌的早期诊断及检测，对我国抗黄锈病甘蔗育种和抗黄锈病甘蔗种质资源的保护具有重要的意义。
文档编号C12R1/645GK102876798SQ20121039701
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月18日 优先权日2012年10月18日
发明者阙友雄, 许莉萍, 黄宁, 郭晋隆, 高世武, 罗俊, 袁照年, 陈如凯 申请人:福建农林大学