一种检测穆汀斯克罗诺杆菌的方法及引物、探针和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测技术，特别涉及穆汀斯克罗诺杆菌核苷酸的引物和探针以及 检测穆汀斯克罗诺杆菌的方法。
【背景技术】
[0002] 穆汀斯克罗诺杆菌（Cronobactermuytjensii)是一种有周生鞭毛、能运动、兼 性厌氧的短杆状革兰氏阴性无芽孢杆菌。其流行病学调查显示，其感染病例大多数为 婴幼儿，主要引起菌血症、脑膜炎、坏死性小肠结膜炎等，并伴随有严重的神经系统后遗 症。克罗诺杆菌广泛分布在婴幼儿奶粉、奶酪、腌肉、水、蔬菜、大米、面包、茶叶、草药、调 味品及豆腐等多种食品及食品原料中。克罗诺杆菌下属10个种，除了最新归类的三种 Cronobacterzurichensis，Cronobacterhelveticus 和 Cronobacterpulveris 等克罗诺杆 菌还未见引起人体疾病的报道，包括穆汀斯克罗诺杆菌（Cronobactermuytjensii)在内的 7种克罗诺杆菌均被证实对人体具有致病性，对特殊人群的致死率高达40-80 %，其中穆汀 斯克罗诺杆菌是唯一一株可在一般用于调料品的香菜上存活的克罗诺杆菌。克罗诺杆菌对 温度和化学物质的敏感性存在较大的差异，而且各种菌的致病因子在特定情况下的表达也 各不相同，从而导致致病力也不尽相同。穆汀斯克罗诺杆菌具有非常强的抵抗干燥和耐渗 透压的能力，这有利于其在婴幼儿配方奶粉干燥环境下存活。因此穆汀斯克罗诺杆菌的快 速准确检测对于由该菌引起的食源性疾病的预防和控制具有十分重要的意义。
[0003] 穆汀斯克罗诺杆菌的检测难点在于穆汀斯克罗诺杆菌同其它克罗诺杆菌以及肠 杆菌科的其他细菌特别是阴沟肠杆菌在形态特征、生理生化特征方面都具有高度相似性， 并有极高的DNA同源性。无论是FDA推荐的传统生化培养法还是各类基于核苷酸片段的检 测方法都不是针对穆汀斯克罗诺杆菌设计的，不能对穆汀斯克罗诺杆菌进行快速准确的鉴 定。二鸟苷酸环化酶广泛存在于各种食源性致病菌中，相关的某些基因片段在许多细菌中 都具有高度的保守性，如霍乱弧菌、沙门氏菌和大肠杆菌。克罗诺杆菌属中参与编码二鸟苷 酸环化酶的CgcA基因能与肠杆菌科其他细菌进行很好的区分，同时具有属内的保守性和 种间等位基因的特异性差异。2012年cgcA基因首次被用于克罗诺杆菌属的快速分型研宄 中，但基于cgcA基因的克罗诺杆菌的核酸检测方法未见报道。本发明在分析已报道穆汀斯 克罗诺杆菌及其他克罗诺杆菌基因组序列的基础上，基于cgcA基因分别设计引物及荧光 探针实现穆汀斯克罗诺杆菌的特异性、快速检测。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于穆汀斯克罗诺杆菌实时荧光定量PCR 检测的引物、探针序列，使得能够快速简单地判断样品是否有穆汀斯克罗诺杆菌，可用于各 种乳制品中致病菌的检测。为了降低对穆汀斯克罗诺杆菌的检测时间，提高穆汀斯克罗诺 杆菌的阳性检出率，本研宄运用基于TaqMam探针的荧光定量PCR技术，建立快速检测的方 法。
[0005] 本发明针对穆汀斯克罗诺杆菌基因组的保守序列设计了用于荧光定量PCR检测 的引物及探针，建立了穆汀斯克罗诺杆菌荧光定量PCR检测技术，反应结束即可根据扩增 曲线判定是否有穆汀斯克罗诺杆菌。
[0006] 其中，上述反应条件可以是：95°C变性Imin ;以95°C 5s，60°C 40s扩增40个循环 (收集荧光）。为了解决上述技术问题，本发明在分析已报道穆汀斯克罗诺杆菌及其他克罗 诺杆菌基因组序列的基础上，基于CgcA基因分别设计引物及荧光探针，所述的引物由正向 引物和反向引物组成，其核苷酸序列如下：
[0007] 上游引物 CMuPFH 序列为 5 'GGGATACGCAGGAGGTGGCA'（SEQ ID NO:2)
[0008] 下游引物 CMuPRl35 序列为 5'GATGCTGCCTGCCAGCAGG'（SEQ ID NO:3)
[0009] 或者上述引物对的上游引物向5'端方向延伸10个碱基，向3'端方向延伸10个 碱基，下游引物向3'端方向延伸10个碱基，向5'端方向延伸10个碱基区域范围内得到的 引物序列。
[0010] 本发明设计的探针的核苷酸序列如下：
[0011] CMuPB64:5 'CATTTTAGCGCTTGATACTCCCCTGGGC3' （SEQ ID N0:4)
[0012] 或者上述探针序列向3'端方向延伸10个碱基和向5'端方向延伸10个碱基区域 范围内得到的探针序列。
[0013] 一种检测穆汀斯克罗诺杆菌的方法，包括如下步骤：
[0014] (1)将上述探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有猝灭荧光染料，得到标记 有荧光素的探针；
[0015] (2)以待测样品的DNA为模板，利用权利要求1所述的上、下游引物以及上述标记 有荧光素的探针进行实时荧光定量PCR反应，每个循环结束后采集数据；
[0016] (3)反应结束后根据扩增曲线判断是否有穆汀斯克罗诺杆菌。
[0017] 所述报告焚光染料采用下列焚光基团中的任意一种：Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、 FITC、Cy3和Cy5 ;所述淬灭荧光染料采用下列荧光基团中的任意一种：Tamra、R〇X、Dabcyl、 BHQl 和 BHQ2。
[0018] 以25 μ 1的反应体系计，所述实时荧光定量PCR反应的条件为：
[0019]
[0020] 所述实时荧光定量PCR反应条件是：95°C变性Imin ;以95°C 5s，60°C 40s扩增40 个循环。
[0021] 一种检测穆汀斯克罗诺杆菌的试剂盒，包括上述上、下游引物以及探针、10XPCR Buffer、dNTPs 和 Taq 酶。
[0022] 以25 μ 1的反应体系计，试剂盒的各组分如下：
[0023]
[0024] 以25 μ 1的反应体系计，试剂盒的各组分如下：
[0025]
[0026] 本发明根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基 团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记的探针的5'端，淬灭荧光染料标记在探针的3' 端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者 距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的 目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切 断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，在扩增延伸阶段将探针切断， 淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对穆汀斯克罗诺杆菌的 检测。
[0027] 当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其它类型的探针， 以适用不同方法的荧光PCR检测。
[0028] 本发明采用的荧光PCR技术是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对 特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测 靶核苷酸序列的技术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：（1)特异性更强， 灵敏度更高：由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，从而提高了特异性，并且由 自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度；（2)定量更 准确可靠：全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR的对数期，摈弃普通PCR方法的受多 因素干扰的终点分析法；(3)适用范围更广：理论上可检测任何穆汀斯克罗诺杆菌的核酸； (4)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰；（5) 不接触有毒试剂，操作安全。但是，荧光定量PCR对引物的要求相对于普通PCR而言，更为 苛刻。
[0029] 本发明根据穆汀斯克罗诺杆菌基因组序列设计的引物特异性好，用于荧光PCR检 测的灵敏度高。本发明检测方法准确性强，灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有穆 汀斯克罗诺杆菌，为各种乳制品中穆汀斯克罗诺杆菌的鉴别诊断提供了科学依据。
【附图说明】
[0030] 图1是实时荧光定量PCR技术穆汀斯克罗诺杆菌核酸检测的特异性实验的检测结 果图；
[0031] 图2是发明检测方法的灵敏度实验的检测结果图；
[0032] 图3是婴幼儿配方奶粉中穆汀斯克罗诺杆菌增菌检测结果图。
【具体实施方式】
[0033] 为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但是本 发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
[0034] 实施例1
[0035] 一种检测穆汀斯克罗诺杆菌的方法，按照以下步骤进行：
[0036] 1.弓丨物与探针的设计及合成
[0037] 从NCBI数据库下载所有的穆汀斯克罗诺杆菌基因组序列，通过对序列 的比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段（SEQ ID ΝΟ:1)，其序列如下：
[0038] 其中斜体加粗分别为上下游引物序列，下划线加粗为探针序列。
[0039] 利用生物软件Primer Express3. 0针对上述区段设计引物和Taqman探针。并通 过NCBI数据库进行了 Blast同源性比对验证，确保序列与其他物种无交叉。引物序列为：
[0040] 上游引物：CMuPF : 5 ' GGGATACGCAGGAGGTGGCA3 '
[0041] 下游