一种检测与早产相关β2肾上腺素受体基因单核苷酸多态性位点的特异性引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测与早产相关β 2肾上腺素受体基因（Aeia-J-ai/reflergic rec6>/7ior，^B^?)单核苷酸多态性位点rsl042713的特异性引物，属分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 早产是围生儿死亡的重要原因之一，发生率为5%~15%，我国的早产发生率为 7. 8%。全球大约有1300百万女性早产，早产使新生儿的死亡率和发病率大幅度升高，并且 对健康有长期的不良影响。早产的婴儿比足月生产的婴儿易患脑瘫，感觉障碍，学习失能 和呼吸系统疾病，通过大量的流行病调查发现，成年后早产仍为心血管病、糖尿病等代谢疾 患的重要因素。根据世界卫生组织评估结果显示，世界每年有一亿三千万新生儿出生，有 八百万在出生一整年之前死亡。早产仍然是由多种因素引起的一个主要公共健康问题。
[0003] 遗传易感性是早产发生过程中不可忽视的一个危险因素，因为早产已被证明表现 出家族性和复发性的特点。对早产的遗传学研宄多是应用基于单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP)标记的关联分析，以研宄早产的遗传易感性。基因多态现 象可能造成了机体对一定刺激作用下所产生的免疫应答有所不同，使一些相关细胞因子和 基因等表达增强或减弱，最终通过炎症反应、凋亡、细胞外基质降解等一个或几个环节导致 早产的发生。
[0004] 近年来，很多学者证明β2肾上腺素受体基因 （Aeia -iSaiZreflergic rece/7 i or, 也祝似)与早产相关，因为该基因可以通过抑制子宫收缩来防止早产的发生。在已知的也祝似 多态性中，我们选取了编码区中的rsl042713多态性位点（Argl6Gly; R16G; rsl042713; A -G)。在rsl042713 (R16G)多态性位点中的精氨酸（A等位基因）是有促进激动剂降低 敏感度的作用，并且纯合子（AA基因型）已经有研宄报道与防止早产相关。
[0005] 目前，检测SNP的方法有很多，包括变性高效液相色谱分析技术（Denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)、高分辨溶解曲线分析法（High resolution melting，HRM)、单链构象多态性分析（Single strand conformation polymorphism, SSCP)、内切酶酶切技术（Endonuclease digestion)、等位基因特异性杂交（Allele specific hybridization，ASH)，SNaPshot 技术，等位基因特异性 PCR (AS-PCR)等方法，但 由于dHPLC、HRM和SNaPshot技术需要昂贵的实验设备，很难在实验室普及。SSCP技术不 能确定突变类型和具体位置，ASH技术操作繁琐且可重复性差，人类基因组中只有不到1/3 的多态性影响限制性内切酶的识别序列，使其应用受到一定的限制。等位基因特异性PCR 方法以简便，快速，成本低等优点被广泛应用于SNP的检测。等位基因特异性PCR特异引物 在一种基因型中有扩增产物，在另一种基因型中没有扩增产物，用凝胶电泳和酶标仪就能 够很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定是否含有多态性位点SNP。酶标仪以其高灵敏 度，可靠性强，易于操作，自动化程度高等优点，更适于批量检测样本SNP位点。
[0006] 经文献检索，未见与本发明相同的利用等位基因特异PCR方法检测突变位点 rsl042713的公开报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的为提供一种检测与早产相关基因 β 2肾上腺素受体U/祝似)基因的 单核苷酸多态性位点rsl042713的特异性引物。
[0008] 本发明一种用于检测与早产相关β 2肾上腺素受体基因 （Ae recepior，也祝似）单核苷酸多态性rsl042713的特异性引物，其特征在于该引物序列见下 表，其中ADRB2-a和ADRB2-g为检测多态性rsl042713的特异性引物，ADRB2-F和ADRB2-R 为验证引物。
[0009] 本发明中，等位基因特异性引物PCR技术是一种简便、特异性较高、费用少的、便 于推广的SNP检测方法，特别适合于大样本群体基因单核苷酸多态性研宄，值得在基因 SNP 研宄中进一步推广。
【附图说明】
[0010] 图1为测序验证rsl042713位置为G/A多态性的峰图。
[0011] 图2为测序验证rsl042713位置为A的峰图。
[0012] 图3为测序验证rsl042713位置为G的峰图。
[0013] 图4为特异性引物梯度PCR产物的电泳图谱。
[0014] 图5为用本发明进行等位基因特异PCR检测rsl042713的电泳图谱。
[0015] 图6为酶标仪检测AS-PCR产物阴性结果和阳性结果的OD值对比图。 具体实施方案
[0016] 本发明利用等位基因特异性PCR的方法检测β 2肾上腺素受体U/祝似)基因的单 核苷酸多态性位点rsl042713,具体步骤如下： (1) 收集临床血液样本，对临床血液样本进行基因组DNA提取 (2) 设计验证引物及位点特异性引物 (3) 以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以包含rsl042713位点的验证引物进行PCR 反应，将得到的PCR产物纯化后，进行直接测序分析，验证存在rsl042713位点多态性。
[0017] (4)以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，以本发明设计的检测多态性位点 rsl042713的特异性引物退火温度进行摸索后，进行PCR扩增。
[0018] (5)利用琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测，根据有无电泳条带并且通过比较分 析酶标仪检测AS-PCR产物的OD值，判断是否含有rsl042713多态性位点。
[0019] (6)与测序结果比对，验证AS-PCR方法检测rsl042713的准确性。
[0020] 表1 AS-PCR所用引物组成、序列及产物大小
本发明基于AS-PCR的原理，设计两条3'末端分别与SNP两个等位基因碱基配对的上 游引物（Seq IDl:ADRB2-a，Seq ID2:ADRB2_g)，同时在两个等位基因特异性引物:V端第 4位碱基引入错配（碱基A突变成碱基T)以增加引物特异性，下游为公用引物（Seq ID4: ADRB2-R)。为检测等位基因特异性PCR方法的可靠性，在远离rsl042713位点设计一条上 游引物（Seq ID3 !ADRB2-F)，利用共同的下游引物ADRB2-R进行PCR后测序验证。无论检 测的标本是否含有rsl042713多态性位点，引物ADRB2-F/ ADRB2-R都会扩增出PCR产物。 PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测，根据有无电泳条带或者酶标仪检测PCR产物的OD光度值 就可以确定样本中是否含有SNP位点。
[0021] 实施例1:米集临床血液样本并进彳丁基因组DNA提取 (1)收集临床早产孕妇和足月产孕妇外周血各20例，所有人员均详细记录临床基本 资料和检测资料，在签署知情同意书后，每人采集血液样本3-5 ml。
[0022] (2)样品基因组DNA提取 使用血液基因组DNA提取试剂盒提取全血样本中基因组DNA。
[0023] 操作步骤： (1)处理血液材料 取200 μ 1的血液样品于I. 5ml离心管中。
[0024] (2)加入 20 μ I Proteinase K 溶液，混勾。
[0025] (3)加200 μ 1缓冲液GB，充分颠倒混勾，56°C放置10 min，其间颠倒混匀数次， 溶液应变清亮。
[0026] (4)加200 μ 1无水乙醇，充分颠倒混勾，此时可能会出现絮状沉淀。
[0027] (5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收 集管中)，12,000 rpm(~13,400Xg )离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入 收集管中。
[0028] (6)向吸附柱 CB3 中加入 500 μ 1 缓冲液⑶，12, 000 rpm(~13, 400Xg )离心 30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0029] (7)向吸附柱 CB3 中加入 600 μL 漂洗液PW，1