一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用。本发明提供的制备核酸芯片的方法，依次包括如下步骤：（1）将表面具有SiO2膜的基片进行表面羟基活化；（2）将步骤（1）得到的基片浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置30-120min后取出基片，洗涤并干燥，然后130-200℃烘烤1-12小时；（3）通过偶联剂将核酸分子固定到基片的表面，得到核酸芯片。在倏逝波激发下，可实时监测核酸芯片表面固定的核酸与互补核酸的杂交情况，同时该核酸芯片还可洗脱再生，实现重复使用（可重复使用50次以上）。
【专利说明】-种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 倏逝波检测技术是一种新型的检测技术，它是利用光波在基质内以全反射方式传 输时在基质表面产生倏逝波，可以激发连接在基质表面标记有荧光分子的生物物质，从而 实现对待测目标物定量或定性的检测。由于其具有不直接与待测物发生作用，穿透深度仅 有数百纳米的特点，因而可有效降低噪音，消除体相中杂质的干扰，特别适合复杂环境中待 测目标物的检测。近年来，发明人所在课题组开发出多种基于倏逝波检测技术的方法和仪 器（如：专利CN1873450A、CN101363870A、CN1966440A、CN101666747A等）并将其成功用于水 体中藻毒素、2、4-D等化合物的检测之中，取得了较好的效果。
[0003] 现代分子生物学研究发现，在分子水平上某些小分子(如金属离子、农药等）可 与特异的基因序列发生作用，造成其空间结构发生改变，而这种结构和性能的关系为这类 小分子的快速、特异识别提供了一条便捷的途径。上述能够发生特异结构变化的DNA或 RNA链，被称为功能核酸（FunctionalNucleicAcids，FNAs)。2008 年MA.Shannon等在 《Nature》上发表文章"Scienceandtechnologyforwaterpurificationinthecoming decades"指出未来二十年，功能核酸(如核酸酶、核酸适体等）为代表的检测技术在环境污 染物的分析上具有广阔的应用前景。
[0004] 利用先前开发的修饰方法，很难消除由于功能核酸在表面的非特异吸附，造成的 固定效率差信号、背景噪音大、重复性不好等问题，因而急需开发功能核酸的固定化方法。 鉴于检测的需要，该方法形成的修饰层应该满足以下条件：（1)能与倏逝波检测芯片共价 结合，不影响芯片的物化性质；（2)能与不同基团(氨基、巯基和羧基等）修饰的寡聚核苷酸 形成共价连接；（3)修饰的寡聚核苷酸数量可控；（4)非特异吸附小，背景信号低；（5)稳定 性好，可多次重复使用，降低使用成本。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用。
[0006] 本发明提供的制备核酸芯片的方法，依次包括如下步骤：
[0007] (1)将表面具有Si02膜的基片进行表面羟基活化；
[0008] (2)将步骤（1)得到的基片浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置30_120min(如 90min-120min、90min或120min)后取出基片，洗涤并干燥，然后130-200°C烘烤1-12小时 (具体可200°C烘烤12小或130°C烘烤1小时）；
[0009] (3)通过偶联剂将核酸分子固定到基片的表面，得到核酸芯片。
[0010] 所述步骤（1)中，所述基片可为硅片、石英片、玻璃片或光纤。所述步骤（1)中，所 述Si02膜的厚度可为20nm以上(如50nm)。所述步骤（1)中，所述"进行表面羟基活化"的 方法如下：将表面具有Si02膜的基片浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，70-1KTC静置45-90分 钟(具体可90°C静置60分钟)后取出基片，洗涤并干燥，然后100-120°C静置3-12h(具体可 110°C静置8小时)。所述硫酸-过氧化氢溶液的制备方法可如下：将3体积份浓硫酸和1 体积份30%过氧化氢混合。所述硫酸-过氧化氢溶液的制备方法具体具体如下：将3体积 份浓硫酸（即质量分数为98. 3%的硫酸溶液）和1体积份30%过氧化氢（即质量分数为30% 的过氧化氢溶液）混合。
[0011] 所述步骤（2)中，所述硅烷化剂具有一个可与偶联剂反应的活性基团和3个硅氧 基，优选为APTES或MTS。所述步骤（2)中，所述硅烷化剂溶液可由硅烷化剂和有机溶剂组 成；所述硅烷化剂与所述有机溶剂的体积配比为（0. 4-5) :100,优选为2 :100、0. 4 :100、5 : 100或4:100。所述有机溶剂可为甲苯或二甲苯。
[0012] 所述步骤（3)中，所述偶联剂为如下（a)或（b)或（c)或（d) :(a)戊二醛；（b) GBMS;(c)EDC和NHS;(d)PIDTC。所述步骤（3)中，所述"通过偶联剂将核酸分子固定到基 片的表面"的方法如下：将步骤（2)得到的基片浸泡于偶联剂溶液，室温静置30-120min(如 60-90min、90-120min、60min、90min或120min)后取出基片，洗涤并干燥，然后在表面滴加 核酸分子溶液，室温静置(具体可为48小时)，洗涤后用蛋白（如牛血清蛋白)进行封闭。所述 偶联剂溶液中，每种偶联剂的体积百分浓度可为〇. 4%-5%，如0. 4%-2%，2%-2. 5%、2. 5%-4%、 4%-5%。所述偶联剂溶液的溶剂可为PBS缓冲液(如pH7. 4的PBS缓冲液)、乙醇、MES缓冲 液(如PH4-6的MES缓冲液，优选为pH5的MES缓冲液）或DMF。所述偶联剂溶液具体可为 含5% (体积比）戊二醛的PBS缓冲液。所述偶联剂溶液具体可为含0. 4% (体积比）GBMS的 乙醇溶液。所述偶联剂溶液具体可为含4% (体积比)EDC和4% (体积比)NHS的pH5、0. 1M 的MES缓冲液。所述偶联剂溶液具体可为含2. 5%PIDTC的DMF。所述偶联剂溶液具体可为 含2% (体积比）戊二醛的PBS缓冲液。
[0013] 所述核酸可为脱氧核糖核酸、核糖核酸或肽核酸。
[0014] 以上任一所述方法制备得到的核酸芯片也属于本发明的保护范围。
[0015] 本发明还保护所述核酸芯片在倏逝波检测中的应用。
[0016] 本发明中通过预处理一硅烷化一高温烘烤一偶联化一固定寡聚核苷酸的工艺流 程，在Si02芯片表面有效的固定了核酸，得到了核酸芯片，固定密度可达108-10 13个/cm2。 在倏逝波激发下，可实时监测核酸芯片表面固定的核酸与互补核酸的杂交情况，同时该核 酸芯片还可洗脱再生，实现重复使用（可重复使用50次以上)。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为实施例1的结果。
[0018] 图2为实施例2的结果。
[0019] 图3为实施例3的结果。
[0020] 图4为对比例的结果。
[0021] 图5为实施例4的结果。
[0022] 图6为实施例5的结果。
【具体实施方式】
[0023] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0024]APTES:购自sigma-aldrich;中文名称为"3-氨丙基三乙氧基硅烷"，分子式为 "H2NCH2CH2CH2Si(0C2H5)3"，CAS号为 "919-30-2"，结构式如下：
[0025]
【权利要求】
1. 一种制备核酸芯片的方法，依次包括如下步骤： (1) 将表面具有Si02膜的基片进行表面羟基活化； (2) 将步骤（1)得到的基片浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置30-120min后取出基片，洗 涤并干燥，然后130-200°C烘烤1-12小时； (3) 通过偶联剂将核酸分子固定到基片的表面，得到核酸芯片。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)中，所述基片为硅片、石英片、 玻璃片或光纤。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)中，所述"进行表面羟基 活化"的方法如下：将表面具有Si02膜的基片浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，70-1KTC静置 45-90分钟后取出基片，洗涤并干燥，然后100-120°C静置3-12h。
4. 如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中，所述硅烷化剂 具有一个可与偶联剂反应的活性基团和3个硅氧基，优选为APTES或MTS。
5. 如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中，所述硅烷化 剂溶液由硅烷化剂和有机溶剂组成；所述硅烷化剂与所述有机溶剂的体积配比为（〇. 4-5): 100。
6. 如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（3)中，所述偶联剂为 如下（a)或（b)或（c)或（d) :(a)戊二醛；（b)GBMS ;(c)EDC 和 NHS ;(d)PIDTC。
7. 如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述"通过偶联剂将核酸分 子固定到基片的表面"的方法如下：将步骤（2)得到的基片浸泡于偶联剂溶液，室温静置 30-120min，后取出基片，洗涤并干燥，然后在表面滴加核酸分子溶液，室温静置，洗涤后用 蛋白进行封闭。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤（3)中，所述偶联剂溶液中，每种偶 联剂的体积百分浓度为〇. 4-5%。
9. 权利要求1至8中任一所述方法制备得到的核酸芯片。
10. 权利要求9所述核酸芯片在倏逝波检测中的应用。
【文档编号】C40B40/06GK104342760SQ201310336822
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月5日 优先权日:2013年8月5日
【发明者】何苗, 韩世同, 施汉昌, 周小红, 龙峰, 刘兰华 申请人:清华大学