专利名称：艾滋病毒原位核酸芯片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及艾滋病的诊断和筛查装置和制备方法，特别适用于艾滋病毒快速、定量检测。
生物芯片技术以其效率高、信息量大的特点在艾滋病毒检测中有重要的应用前景。目前已有报道的涉及艾滋病毒诊断的生物芯片技术主要有两类。
一类是对待测的基因进行序列分析。如美国Affymetrix公司1999年1月19日申请公开的美国专利US Patent 5,861,242“Array of nucleic acidprobes on biological chips for diagnosis of HIV and methods of usingthe same”，公开了一种用于HIV序列分析的由上万个寡核苷酸构成的高密度寡核苷酸探针阵列芯片，该探针阵列中对HIV保守序列的每个核苷酸有至少四个与之互补的寡核苷酸探针。探针采用光导化学合成法，生成固定在固体支撑物上。
另一类是用待测病原体的特征基因片段作为探针，与血样中提取的、经扩增标记荧光的DNA或RNA进行杂交，判断阴阳性。如武汉大学申请国家知识产权局2000年10月25日公开的发明专利“性病的集成诊断芯片及其制备方法”，公告号CN1271098，该发明公开了一种性病的集成诊断芯片以及这种芯片的制备方法，它是在玻璃或硅片上光刻有微坑阵列，这些阵列分为八个区域，依次在这些微坑中采用通常的化合键合法固定有包含爱滋病等八种性病病原的具诊断意义的特征基因或其引物。上海博道基因技术有限公司申请国家知识产权局于2001年8月29日公开的发明专利“用于感染性疾病乙肝病毒、梅毒螺旋体、爱滋病毒和丙肝病毒诊断的基因芯片”，公告号CN1310236，该发明公开了一种用于感染性疾病HBV、TP、HIV和HCV诊断的基因芯片，该基因芯片包括检测监控和疾病诊断两个系统，其中疾病诊断系统设有选自上述四种感染性疾病病原体核酸的保守区序列的探针，可以同时对上述四种感染性病毒进行检测。
上述已有芯片技术，首先在探针构成上，前者采用高密度阵列可对靶基因进行序列分析，但使芯片成本过高，不适于日常的临床诊断；后者只采用一种特征基因片段，不能进行艾滋病毒的分型检测。
其次，芯片检测是利用荧光素等标记靶基因的荧光标记法，用高分辨荧光扫描仪获得结合于芯片上靶基因的荧光信号进行分析测试。荧光标记法存在一些严重的不足，如检测需前标记靶基因，需在杂交反应完成并洗脱未结合标记物后才能进行检测，检测设备复杂且成本高，对检测条件有极其严格的要求，操作冗繁，难以实现自动化、小型化等等。
再次，只能进行是否存在艾滋病毒的定性检测，而不能进行艾滋病毒的定量分析。
现有艾滋病毒芯片技术存在的上述问题，严重限制了其推广应用。
艾滋病毒原位核酸芯片包括基片、固定在基片上的微型电极阵列，各微型电极分别由电极引线与检测电路连接，在微型电极阵列中，以每两个微型电极构成一个传感器，两个微型电极之间的空间距离为10μm-10mm，传感器之间的空间距离至少要10μm以上，微型电极阵列所构成的各传感器产生信号的区域内分别对应地固化有不同的艾滋病毒核酸片段作为探针，组成艾滋病毒探针阵列。
本发明采用在基片上制作结构相同的微型传感器阵列，在每一个传感器上固化一种艾滋病毒的特征核酸片段作为探针，构成在使用时能通过传感器的响应原位获取探针与靶核酸反应信息的艾滋病毒原位核酸芯片来实现其目的。
上述的基片是硅、或石英、或玻璃、或塑料等半导体或绝缘材料。
上述的微电极是金、或银、或铜、或铝等金属导电材料。
上述的艾滋病毒核酸探针是艾滋病毒的特征基因片段，一种探针对应一种艾滋病毒，包括各种亚型的艾滋病毒。一探针固化在一传感器的一个或两个电极的(2)表面上、或固化在传感器两电极间的基片(5)上、或固化在一个传感器的两微型电极及其之间的区域上。
上述的各种艾滋病毒特征基因片段选自各种HIV病毒的保守区，各种HIV病毒保守区靶基因为已有公开技术，共设计了34种探针，其序列如表1所示表1艾滋病毒核酸探针序列
适用于本发明的艾滋病毒原位核酸芯片的检测对象即靶物质，可以是各种艾滋病毒的DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)，探针可以是按照艾滋病毒的特征核酸片段的序列合成的寡核苷酸。由于一个传感器上对应有一种探针，而由多个传感器构成的阵列芯片上对应有由多种探针构成的探针组，因此可对包括所有已知的各种艾滋病毒进行检测。
当将含有靶物质的样品溶液与本原位芯片接触时，靶物质被相应的探针捕获，探针—靶的相互作用将导致传感器响应(电参数)的变化，由此，通过电参数测量可对原位芯片内每一传感器上特定的靶物质—探针结合进行动态实时监测，从而实现对靶物质的测定。
本发明的艾滋病毒原位核酸芯片的制备方法如下1)制作基片(1)，2)在基片上用微电子技术制作微型电极阵列，(1)将金属电极材料在基片(1)上蒸发镀膜，(2)采用光刻法制出电极图形，再采用反应离子腐蚀法，按电极图形腐蚀去除多余的金属层制出微电极(2)阵列及其引线(3)，3)在各微电极(2)上，或微电极间的基片上，采用化学键合法、或自组装法，分别固化各种艾滋病毒核酸探针(4)，构成艾滋病毒核酸探针阵列，制成本艾滋病毒原位核酸芯片。
上述的光刻法、反应离子腐蚀法、化学键合法、自组装法均为已有公开技术。
本发明与已有生物芯片及其制备方法相比较，具有如下的明显优点和显著效果。
本发明一是采用微电子技术制作芯片，可大批量生产，二是采用各种HIV病毒的特征基因段构建艾滋病毒的核酸探针阵列，可全面准确地检测各种亚型的艾滋病毒，而无须高密度的探针阵列，因此大大降低了芯片成本。
本发明采用微型传感器，通过测量探针—靶结合所致的一种电信号的变化，原位、实时直接检测探针—靶的相互作用，一是HIV靶核酸无须偶联荧光素等标记物，使用简便，二是所需电子测量设备简单，易于实现小型化、自动化，对使用环境的要求也不高。高效快速、准确灵敏、检测方便，可同时检测多种艾滋病病毒核酸的多个片段，实现对艾滋病的诊断、病情及疗效的动态跟踪等。
本发明的艾滋病毒原位核酸芯片使用时，一是不存在对未结合标记物的清洗，二是无须标记而减少了样本制备时间，三是只要有足够的结合量使电信号有明显变化而无须等待反应完成，因此可大大缩短检测时间。
本发明与利用传感器信号变化量与传感器上靶病毒核酸的结合量有关，可用于对HIV病毒进行定量分析。
图1中，1为基片，2为微电极，3为电极引线，4为传感器两电极间基片区域，探针在图中未示出。
2)在基片上用微电子技术制作微型电极阵列(1)在基片1上蒸镀或溅射电极金属材料，如金、或银、或铂、或镍铬合金，制出厚100nm-5000nm的金属薄膜。
(2)采用光刻法制出电极图形，再采用反应离子腐蚀法，按电极图形腐蚀制出微电极2的阵列及其引线。在基片上平行对齐地装了两排，每排由6个传感器组成的阵列，每一微电极长0.2-2mm、宽0.2-2mm，每一传感器的两个微型电极的空间距离为0.2-2mm，引线宽0.1-1mm，在12个传感器的两微型电极间的基片上分别固化有12种不同的艾滋病毒核酸探针。
3)在传感器表面固定探针本发明的艾滋病毒核酸探针根据HIV特征基因片段设计，共设计了34种，如前表1所示。可全部选用，也可根据需要选用其中的几种，如在图1所示的芯片上可选用表1中1-12号探针。
探针固定在传感器的一对电极上，也可固定在传感器电极间基片区域上。当探针固定在金、氧化铌、氧化铱、铂、钛、钽、钨及其它金属表面时，这些金属表面能通过与探针上的有机巯基连接形成稳定的偶合物。如一5’或3’端标记上巯基的合成DNA探针可与金等金属形成稳定的偶合物。当探针固定在用作基片的玻璃表面时，可通过与环氧硅烷反应使其环氧基功能化，在玻璃上的环氧基与5’-氨基-衍生寡核苷酸探针反应，形成一仲胺共价联接，而将探针联接到玻璃的表面。如5’醛或羧酸、氨基和磷酸的衍生物可分别与酰肼、重氮化活化以及氮基修饰的聚苯乙烯结合。
探针的固定可在合成各种探针后，采用微量移液管或微喷头或针头将各种探针逐点分布在基片表面各相应的位点上。
使用本发明的艾滋病毒核酸原位芯片，对艾滋病毒核酸进行检测的传感检测可用成熟的各种电学或电磁学方法，以下对其中的交流电导法作一介绍交流电导GAC＝εA/d，式中，A为电极的有效面积、d为电极间的有效距离，两者之比对所用芯片而言为一常数；而ε为介电常数，取决于电极表面以及其间介质的性质和状态。在检测过程中，GAC将随着传感器上是否存在核酸杂交、核酸杂交的量的变化而变化。因此可通过测量芯片上传感器的交流电导，对探针与靶核酸的反应进行原位实时检测，从而判断是否存在某种艾滋病毒，并可测定出该艾滋病毒核酸的量。
权利要求
1.一种艾滋病毒原位核酸芯片，包括基片、固定在基片上的微型电极阵列，各微型电极分别由电极引线与检测电路连接；其特征在于每两个微型电极构成一个传感器，两个微型电极之间的空间距离为10μm-10mm，传感器之间的空间距离至少要10μm以上，微型电极阵列所构成的各传感器产生信号的区域内分别对应地固化有不同的艾滋病毒核酸片段作为探针，组成艾滋病毒探针阵列。
2.根据权利要求1所述的艾滋病毒原位核酸芯片，其特征在于该芯片的基片长20mm，宽13mm，在基片上平行对齐地装了两排，每排由6个传感器组成的阵列，每一微型电极长为0.2-2mm，宽为0.2-2mm，厚为100nm-5000nm的金属薄膜，每一传感器的两个微型电极的空间距离为0.2-2mm，电极引线宽0.1-1mm，在12个传感器的两微型电极间的基片上分别固化有12种不同的艾滋病毒核酸探针。
3.根据权利要求1所述的艾滋病毒原位核酸芯片，其特征在于每一艾滋病毒核酸探针固化在一个传感器的一个或两个微型电极的表面上。
4.根据权利要求1所述的艾滋病毒原位核酸芯片，其特征在于每一艾滋病毒核酸探针固化在一个传感器两微型电极间的基片上。
5.根据权利要求1所述的艾滋病毒原位核酸芯片，其特征在于每一艾滋病毒核酸探针固化在一个传感器的两微型电极及其之间的区域上。
全文摘要
一种艾滋病毒原位核酸芯片及其制备方法，涉及艾滋病的诊断、筛查装置及制备方法。该芯片包括芯片、固定在基片上的微型电极阵列和与各微型电极固定连接的电极引线。微型电极阵列中每两个微型电极构成一个传感器，在微型电极所构成的各传感器产生信号的区域内分别对应地固化有不同的艾滋病毒核酸片段作为探针，组成艾滋病毒探针阵列。其制备方法包括制作基片、在基片上制作微型电极阵列、分别固化各种艾滋病毒核酸探针。本发明可同时高效快速、无须标记、自动简便地检测多种艾滋病毒核酸的多个片段，实现对艾滋病的诊断及其原位跟踪，大大降低了芯片成本，准确灵敏，检测时间缩短，可用于对艾滋病毒进行定量分析。
文档编号C07H21/04GK1429917SQ0213389
公开日2003年7月16日 申请日期2002年10月11日 优先权日2002年10月11日
发明者薛永新, 莫志宏, 靳萍, 田学隆, 郭钢 申请人:薛永新, 莫志宏, 靳萍, 田学隆, 郭钢