专利名称：一种螺甾皂苷和呋甾皂苷的分离、检测方法
技术领域：
本发明涉及化学领域的分离提取方法和检测方法，具体地，涉及螺甾皂苷和呋甾皂苷的分离方法和检测方法。
背景技术：
甾体皂甙(steroidal saponins)是一类由27个碳原子组成的具有甾体结构母核的化合物，根据其分子中F环的结构状态，分为螺甾型(spirostane)甾体皂甙、呋甾型(furostane)甾体皂甙、呋喃螺甾型(furospirostane)皂甙三类，以螺甾皂甙和呋甾皂甙最为常见，广泛分布于百合科、薯蓣科、龙舌兰科、延龄草科、藜科、茄科等植物中，是许多重要中药的组成成分，如知母、麦冬、重楼、薯蓣、黄精、天冬、玉竹、蒺藜、血竭、薤白、萆等均含有大量的甾体皂甙，具有广泛的生理活性和作用，是一类重要的中药活性成分之一；国内以甾体皂甙为原料开发的天然药物有心脑舒通、地奥心血康、宫血宁、冠心宁、维奥欣等。螺甾皂甙和呋甾皂甙同时大量存在于植物之中，虽然呋甾型甾体皂苷在植物中酶和一些微生物及酸性条件下可部分转化为螺甾型甾体皂甙，但同时对皂苷的组成和糖链有影响。螺甾皂苷和呋甾皂苷的作用和活性不完全相同，呋甾型甾体皂甙大多不具有许多皂甙的通性，如没有溶血作用、没有抗菌的活性等，螺甾型甾体皂甙具有明显的抗霉菌作用、抗细菌作用；螺甾皂苷的活性往往强于或大于呋甾皂苷，如呋甾型甾体皂苷原洋菝葜皂甙(sarsaparilloside)既没有溶血活性，也没有抗菌活性，而螺甾型甾体皂苷洋菝葜皂甙(parillin)不仅有溶血活性，也具有强的抗霉菌活性和抗细菌活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种现有技术中没有的天然产物中螺甾型甾体皂甙和呋甾型甾体皂甙的分离方法。
为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案一种螺甾皂苷和呋甾皂苷的分离方法，利用盐析的方法先将大量的螺甾型甾体皂苷从溶液中沉淀出来，再利用吸附树脂脱除溶液中的杂质，然后再用洗脱剂分别将呋甾型和螺甾型甾体皂苷洗脱下来。
根据上述的分离方法，取含甾体皂苷的植物原料或中药，粉碎成40-80目，用50-90％的乙醇或甲醇3-10倍量加热(60-80℃)回流提取3次，每次3小时，过滤，合并滤液，减压回收乙醇或甲醇至溶液不含乙醇或甲醇，溶液呈粘稠状，加入3-10倍量的1-5％的盐水溶液进行稀释，搅拌，放置析出沉淀，待沉淀完全，过滤，沉淀再用3-10倍的水充分洗涤2-3次，至检测沉淀不含呋甾皂苷为止，干燥，得螺甾型甾体皂苷。滤液通过吸附树脂柱吸附，先用水洗涤，待水洗至无色，洗去糖等杂质，再用10％的甲醇溶液洗脱，去除非甾体皂苷成分杂质，改用40-70％的乙醇或甲醇溶液洗脱，收集40-70％洗脱液，至检验不含呋甾皂苷为止，得呋甾皂苷洗脱液，回收溶剂，干燥得呋甾皂苷。最后用甲醇或乙醇洗脱，收集洗脱液，回收甲醇或乙醇至检测无皂苷反应为止，回收甲醇或乙醇，干燥，得螺甾型甾体皂苷，与上面第一步干燥所得的螺甾型甾体皂苷合并，得总的螺甾型甾体皂苷提取物部位。
根据上述的分离方法，取含甾体皂苷的植物原料或中药原料，粉碎加70％的乙醇，加热至80℃回流提取3小时，乘热过滤，收集滤液；残渣再加入70％的乙醇，加热至80℃回流提取3小时，过滤，滤液与第一次提取滤液合并；滤渣再加70％的乙醇，如前加热提取一次，过滤，合并三次滤液，70℃减压回收乙醇至无醇蒸出，回收乙醇，溶液呈粘稠糖浆状，冷却，边搅拌边加入配制好的5％的氯化钠水溶液，溶液呈混状，停止搅拌，放置12小时，待沉淀完全，过滤，滤渣用蒸馏水洗涤三次，过滤，滤渣用TLC检测，E-试剂显色不呈红色，置60℃真空干燥48小时，得螺甾型甾体皂苷，再经TLC检测，A-试剂呈黄色，E-试剂不显色；以上滤液和洗液全部合并，加至经处理和平衡稳定好的大孔吸附树脂柱(D-130，15cm×100cm)，用蒸馏水冲洗，至洗脱液呈无色，将糖等杂质去除干净，再改用60％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液至经TLC检测，E-试剂显色不呈红色为止，回收乙醇至干，于60℃真空干燥，得呋甾型甾体皂苷，再用TLC检测，E-试剂呈红色，A-试剂呈黄色；树脂柱再用90％的乙醇洗脱，收集洗脱液至A-试剂不呈黄色为止，回收乙醇至干，于60℃真空干燥，得螺甾型甾体皂苷，再用TLC检测，E-试剂不显色，A-试剂呈黄色。
本发明同时提供了上述方法分离出的螺甾皂苷和呋甾皂苷的检测方法，即在分离方法中使用E-试剂、A-试剂对分离结果进行检测，呋甾型甾体皂甙对E-试剂(1％二甲氨基苯甲醛10％盐酸乙醇溶液)显红色，对A-试剂(1％茴香醛10％硫酸甲醇溶液)显黄色，而螺甾型甾体皂甙只对A-试剂显黄色，对E-试剂不显色。本发明上述技术方案的提出是基于如下的原理呋甾型甾体皂甙分子结构中F环裂开，C-26位羟基化(-OH)并与糖(往往为葡萄糖)形成苷键，大多数为双糖链皂甙；螺甾型甾体皂甙F环闭合成吡喃环，F环C-26位不与糖形成糖苷键，且大多数螺甾型甾体皂甙为单糖链皂甙。由于结构上的差异，螺甾型甾体皂甙在水中的溶解性比较差，在单体状态时几乎不溶于水、在水中的溶解度很小，螺甾皂苷在水中的溶解性小于呋甾皂苷；呋甾型甾体皂苷在水中的溶解性比较大，可溶于水。但在混合状态尤其是提取条件下螺甾型甾体皂苷在水中也有一定的溶解度(共溶作用)，呋甾皂苷在水中虽有一定的溶解性，但在提取回收时随着螺甾型甾体皂苷的析出也可部分从水中析出而沉淀。利用它们的这一性质，我们在螺甾和呋甾的混合提取液中加入一定数量的盐溶液，以降低螺甾皂苷的溶解度，足使其沉淀完全，然后再用水充分洗涤，将其中的呋甾皂苷溶解出来，然后经吸附树脂进行纯化，从而达到分离的目的，将螺甾型甾体皂苷和呋甾型甾体皂苷分离开来，并应用TLC的方法，以E-试剂和A-试剂为显色剂对分离结果进行了验证。
综上，本发明的分离和检测方法的优益性在于1.本发明提供了一种螺甾皂苷和呋甾皂苷的分离方法。
2.本发明所提供的分离方法是基于呋甾型甾体皂苷和螺甾型甾体皂苷结构上的差异和溶解性差异而进行分离的。
3.本发明所提供的快速分离方法是利用盐析的方法先将大量的螺甾型甾体皂苷从溶液中沉淀出来，再利用吸附树脂脱除溶液中的杂质，然后再用洗脱剂分别将呋甾型和螺甾型甾体皂苷洗脱下来，达到分离的目的。
4.本发明在提供了一种快速的螺甾型甾体皂苷和呋甾型甾体皂苷的分离方法的同时，提供了一种快速的分析检测方法。
图1为本发明分离的螺甾型甾体皂苷的结构图；图2为本发明分离的呋甾型甾体皂苷的结构图。
具体实施例方式实施例1取新鲜黄山药(Dioscorea panthaica Prain et Burkill)5.1Kg，切碎加70％的乙醇12.5L，加热至80℃回流提取3小时，乘热过滤，收集滤液；残渣再加入70％的乙醇12.5L，加热至80℃回流提取3小时，过滤，滤液与第一次提取滤液合并；滤渣再加70％的乙醇12.5L，如前加热提取一次，过滤，合并三次滤液，70℃减压回收乙醇至无醇蒸出，回收乙醇28L，溶液呈粘稠糖浆状，冷却，边搅拌边加入25L配制好的5％的氯化钠水溶液，溶液呈混状，停止搅拌，放置12小时，待沉淀完全，过滤，滤渣用蒸馏水洗涤三次，每次5L，过滤，滤渣用TLC检测，E-试剂显色不呈红色，置60℃真空干燥48小时，称重得螺甾型甾体皂苷44g，再经TLC检测，A-试剂呈黄色，E-试剂不显色。以上滤液和洗液全部合并，加至经处理和平衡稳定好的大孔吸附树脂柱(D-130，15cm×100cm)，用25L蒸馏水冲洗涤，至洗脱液呈无色，将糖等杂质去除干净，再改用60％的乙醇溶液25L洗脱，收集乙醇洗脱液至经TLC检测，E-试剂显色不呈红色为止，回收乙醇至干，于60℃真空干燥，称重得呋甾型甾体皂苷56g，再用TLC检测，E-试剂呈红色，A-试剂呈黄色。树脂柱再用90％的乙醇20L洗脱，收集洗脱液至A-试剂不呈黄色为止，回收乙醇至干，于60℃真空干燥，称重，再得到螺甾型甾体皂苷26g，再用TLC检测，E-试剂不显色，A-试剂呈黄色。总共得到螺甾型甾体皂苷70g，得率1.4％，呋甾型甾体皂苷56g，得率1.1％。
实施例2取新鲜小花盾叶薯蓣(Dioscorea parviflora C.T.Ting)根茎5.2Kg，切碎，加80％的甲醇12.5L加热至70℃回流提取3小时，乘热过滤，收集滤液；残渣再加入80％的甲醇12.5L，加热至70℃回流提取3小时，过滤，滤液与第一次提取滤液合并；滤渣再加70％的甲醇12.5L，如前加热提取一次，过滤，合并三次滤液，加热至60℃减压回收甲醇至无醇蒸出，回收甲醇29L，溶液呈粘稠糖浆状，冷却，边搅拌边加入25L配制好的5％的氯化钠水溶液，溶液呈混状，停止搅拌，放置24小时，待沉淀完全，过滤，滤渣用蒸馏水洗涤三次，每次5L，过滤，滤渣用TLC检测，E-试剂显色不呈红色，置60℃真空干燥48小时，称重得螺甾型甾体皂苷74g，再经TLC检测，A-试剂呈黄色，E-试剂不显色。上面所得滤液和洗液全部合并，加至经处理和平衡稳定好的大孔吸附树脂柱(D-130，15cm×100cm)，用25L蒸馏水冲洗涤，至洗脱液呈无色，将糖等杂质去除干净，再用10％的甲醇溶液10L洗涤，洗脱液中经TLC检验，E-试剂显色不含甾体皂苷，改用70％的甲醇溶液25L洗脱，收集甲醇洗脱液至经TLC检测，E-试剂显色不呈红色为止，回收甲醇至干，于60℃真空干燥，称重得呋甾型甾体皂苷141g，再用TLC检测，E-试剂呈红色，A-试剂呈黄色。树脂柱再用工业甲醇20L洗脱，收集洗脱液至A-试剂不呈黄色为止，回收甲醇至干，60℃真空干燥，称重，再得到螺甾型甾体皂苷16g，再用TLC检测，E-试剂不显色，A-试剂呈黄色。总共得到螺甾型甾体皂苷110g，得率2.12％，呋甾型甾体皂苷141g，得率2.71％。
实施例3取番麻(Agave americana L.)叶渣3Kg，粉碎，加70％的甲醇10L加热至70℃回流提取3小时，乘热过滤，收集滤液；残渣再加入70％的甲醇10L，加热至70℃回流提取3小时，过滤，滤液与第一次提取滤液合并；滤渣再加70％的甲醇10L，如前加热提取一次，过滤，合并三次滤液，60℃减压回收甲醇至无醇蒸出，回收甲醇24L，溶液呈粘稠糖浆状，冷却，边搅拌边加入25L配制好的5％的氯化钠水溶液，溶液呈混状，停止搅拌，放置24小时，待沉淀完全，过滤，滤渣用蒸馏水洗涤三次，每次5L，过滤，滤渣用TLC检测，E-试剂显色不呈红色，置60℃真空干燥48小时，称重得螺甾型甾体皂苷143g，再经TLC检测，A-试剂呈黄色，E-试剂不显色。上面所得滤液和洗液全部合并，加至经处理和平衡稳定好的大孔吸附树脂柱(D-130，15cm×100cm)，用20L蒸馏水冲洗涤，至洗脱液呈无色，将糖等杂质去除干净，再用10％的甲醇溶液10L洗涤，洗脱液中经TLC检验，E-试剂显色不含甾体皂苷，改用60％的甲醇溶液30L洗脱，收集甲醇洗脱液至经TLC检测，E-试剂显色不呈红色为止，回收甲醇至干，于60℃真空干燥，称重得呋甾型甾体皂苷168g，再用TLC检测，E-试剂呈红色，A-试剂呈黄色。树脂柱再用工业甲醇20L洗脱，收集洗脱液至A-试剂不呈黄色为止，回收甲醇至干，60℃真空干燥，称重，再得到螺甾型甾体皂苷46g，再用TLC检测，E-试剂不显色，A-试剂呈黄色。总共得到螺甾型甾体皂苷189g，得率6.3％，呋甾型甾体皂苷168g，得率5.6％。
权利要求
1.一种螺甾皂苷和呋甾皂苷的分离方法，其特征是利用盐析的方法先将大量的螺甾型甾体皂苷从溶液中沉淀出来，再利用吸附树脂脱除溶液中的杂质，然后再用洗脱剂分别将呋甾型和螺甾型甾体皂苷洗脱下来。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征是取含甾体皂苷的植物原料或中药，粉碎成40-80目，用50-90％的乙醇或甲醇3-10倍量在60-80℃加热回流提取3次，每次3小时，过滤，合并滤液，减压回收乙醇或甲醇至溶液不含乙醇或甲醇，溶液呈粘稠状，加入3-10倍量的1-5％的盐水溶液进行稀释，搅拌，放置析出沉淀，待沉淀完全，过滤，沉淀再用3-10倍的水充分洗涤2-3次，至检测沉淀不含呋甾皂苷为止，干燥，得螺甾型甾体皂苷，滤液通过吸附树脂柱吸附，先用水洗涤，待水洗至无色，洗去糖等杂质，再用10％的甲醇溶液洗脱，去除非甾体皂苷成分杂质，改用40-70％的乙醇或甲醇溶液洗脱，收集40-70％洗脱液，至检验不含呋甾皂苷为止，得呋甾皂苷洗脱液，回收溶剂，干燥得呋甾皂苷，最后用甲醇或乙醇洗脱，收集洗脱液，回收甲醇或乙醇至检测无皂苷反应为止，回收甲醇或乙醇，干燥，得螺甾型甾体皂苷，与上面第一步干燥所得的螺甾型甾体皂苷合并，得总的螺甾型甾体皂苷。
3.根据权利要求1或2所述的分离方法，其特征是取含甾体皂苷的植物原料或中药原料，粉碎加70％的乙醇，加热至80℃回流提取3小时，乘热过滤，收集滤液；残渣再加入70％的乙醇，加热至80℃回流提取3小时，过滤，滤液与第一次提取滤液合并；滤渣再加70％的乙醇，如前加热提取一次，过滤，合并三次滤液，70℃减压回收乙醇至无醇蒸出，回收乙醇，溶液呈粘稠糖浆状，冷却，边搅拌边加入配制好的5％的氯化钠水溶液，溶液呈混状，停止搅拌，放置12小时，待沉淀完全，过滤，滤渣用蒸馏水洗涤三次，过滤，滤渣用TLC检测，E-试剂(1％二甲氨基苯甲醛10％盐酸乙醇溶液)显色不呈红色，置60℃真空干燥48小时，得螺甾型甾体皂苷，再经TLC检测，A-试剂(1％茴香醛10％硫酸甲醇溶液)呈黄色，E-试剂不显色；以上滤液和洗液全部合并，加至经处理和平衡稳定好的大孔吸附树脂柱(D-130，15cm×100cm)，用蒸馏水冲洗，至洗脱液呈无色，将糖等杂质去除干净，再改用60％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液至经TLC检测，E-试剂显色不呈红色为止，回收乙醇至干，于60℃真空干燥，得呋甾型甾体皂苷，再用TLC检测，E-试剂呈红色，A-试剂呈黄色；树脂柱再用90％的乙醇洗脱，收集洗脱液至A-试剂不呈黄色为止，回收乙醇至干，于60℃真空干燥，得螺甾型甾体皂苷，再用TLC检测，E-试剂不显色，A-试剂呈黄色。
4.检测权利要求1分离出的螺甾皂苷和呋甾皂苷的方法，其特征是在分离方法中使用E-试剂、A-试剂对分离结果进行检测，呋甾型甾体皂甙对E-试剂(1％二甲氨基苯甲醛10％盐酸乙醇溶液)显红色，对A-试剂(1％茴香醛10％硫酸甲醇溶液)显黄色，而螺甾型甾体皂甙只对A-试剂显黄色，对E-试剂不显色。
全文摘要
一种螺甾皂苷和呋甾皂苷的分离方法,利用盐析的方法先将大量的螺甾型甾体皂苷从溶液中沉淀出来,再利用吸附树脂脱除溶液中的杂质,然后再用洗脱剂分别将呋甾型和螺甾型甾体皂苷洗脱下来。
文档编号C07J21/00GK1389469SQ0213343
公开日2003年1月8日 申请日期2002年7月4日 优先权日2002年7月4日
发明者刘锡葵, 杨崇仁 申请人:中国科学院昆明植物研究所