专利名称：一段阴道加德纳氏杆菌dna序列(4)特异性的确定及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一段阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)DNA序列(4)特异性的确定及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)是一种妇女阴道经常感染的病原物，准确的诊断是进行即时而可靠的治疗的依据，目前只能根据临床指征进行诊断。PCR和基因芯片诊断是一种快速而准确的检测方法。而这一类的诊断方法依赖于获得特异的核酸序列。
发明内容
本发明在于通过生物信息学和分子生物学技术，确定了一段阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)特异核苷酸序列及其PCR引物。该序列和相应的PCR引物可用于建立基因芯片和PCR方法进行阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)的诊断。
本发明的技术方案为本发明利用现有的方法确定了长度为190bp的一段阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)特异DNA序列(4)及其PCR引物，用引物进行PCR扩增，其序列如下tcttcaatgc gatgcttacg ttccttagcc tcaacttccg tagcagcacc aaccttaata 60acagcaacgc cgccagcgag cttagcaaga cgctcctgaa gcttttcgcg atcgtaatcg 120gaatcagtgt tctcaatttc ggcgcgaatc agagcaacac gagcctcaac atcttcctta 180gagccagcga 190引物序列为1.5’-cgctggctctaaggaagatg-3’2.5’-tcttcaatgcgatgcttacg-3’上述的阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)特异DNA序列(4)用于诊断阴道加德纳氏杆菌的基因芯片的探针序列，并通过上述的引物序列进行PCR扩增，标记后进行杂交检测或直接用于PCR诊断。
用本发明建立的临床检测技术所使用的方法具有快速、准确、操作简便、成本低等优点。
图1为临床标本的PCR扩增图谱。
图2、图2续是测序图。其中图2是测定的序列、图2续是原始测序图谱。
图3是用Blast软件对PCR扩增产物的测序结果与预计序列的比较分析。
图4、图4续(1)、图4续(2)、图4续(3)、图4续(4)是基因数据库中Blast搜索结果。
图5为基因芯片杂交结果。
具体实施例方式首先以阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)为关键词，在基因数据库中搜索阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)的核苷酸序列。共获得数条关系较密切的核苷酸序列，将这些核苷酸序列用NCBI网上的Blast在线使用软件比对基因数据库中的核苷酸序列(nr)，排出非特异性的核苷酸序列，获得了1Kb特异性的核苷酸序列。以这段序列设计了20余对PCR引物，以临床标本提取DNA，进行PCR扩增，筛选到一对适合进行PCR扩增的序列及引物，PCR扩增获得的产物与预计大小一致(见图1，图中序号1为标准分子量DNA，分子量大小从上至下分别为622，527，404，309，242/238，217，201，190，180，160+160，147+147，123；2.4.5为临床阴性标本，没有扩增产物；3为临床阳性标本，扩增产物很纯，大小190左右，与预计大小一致。图谱结果显示用本发明中的引物能特异的扩增临床样品)，然后用T-vector进行克隆，并测序(测序报告见图2、图2续，图中从59位开始，到248位，共190bp为克隆序列，其余序列为克隆载体序列)，序列为190bp，通过Blast软件比对预计序列，显示与预计的序列一致(见图3，图中除第93位由c改变成t，第151位由a改变成t外，其余均与预计序列一致)，表明该序列可以被特异性的扩增，可用于阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)PCR检测。序列用NCBI网站的Blast搜索基因数据库的DNA(包含cDNA)序列，该序列只与阴道加德纳氏杆菌(Gardnerellavaginalis)的序列一致，而与其它的物种序列没有同源性见图4、图4续(1)、图4续(2)、图4续(3)、图4续(4)，图中搜寻结果表明，只有阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)的质粒DNA序列与本序列同源，并且是完全配对，有一段约70bp的序列同源，也是阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)的序列。而其它的序列只有40字符左右的短序列，由于这些序列没有引物与此配对，故在检测中不会被检测到。用这一序列标记后作为探针与含有9种泌尿生殖道感染病原物的45个基因位点的基因芯片杂交，只有本发明序列与此有杂交信号，而其它所有序列与此无杂交信号(见图5，图中是4个重复，每个重复含9种泌尿生殖道感染性疾病病原物共45个不同的位点和4个对照位点。杂交结果表明只有本序列有特异信号，而其它均无杂交信号)，表明该序列为阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)的特异序列。
本发明可用于PCR方法或基因芯片方法进行阴道加德纳氏杆菌(Gardnerellavagihalis)的临床检测。用本发明提供的序列进行PCR扩增，根据PCR方法获得产物是否出现和大小判断是否为阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)感染。也可用本序列为探针，作为基因芯片中的一个检测位点，然后用本发明中的PCR引物序列扩增临床标本，并标记后进行杂交检测。
说明书序列表<110>昆明寰基生物芯片开发有限公司<120>一段阴道加德纳氏杆菌DNA序列(4)特异性的确定<140>
<141>
<160>1<210>1<211>190<212>DNA<213>阴道加德纳氏杆菌(Gardnerella vaginalis)<220>
<221>gene<222>(1)…(190)<400>1tcttcaatgc gatgcttacg ttccttagcc tcaacttccg tagcagcacc aaccttaata 60acagcaacgc cgccagcgag cttagcaaga cgctcctgaa gcttttcgcg atcgtaatcg 120gaatcagtgt tctcaatttc ggcgcgaatc agagcaacac gagcctcaac atcttcctta 180gagccagcga 190
权利要求
1.一段阴道加德纳氏杆菌DNA序列(4)特异性的确定，其特征在于该序列的长度为190bp，其序列及PCR引物如下tcttcaatgc gatgcttacg ttccttagcc tcaacttccg tagcagcacc aaccttaata 60acagcaacgc cgccagcgag cttagcaaga cgctcctgaa gcttttcgcg atcgtaatcg 120gaatcagtgt tctcaatttc ggcgcgaatc agagcaacac gagcctcaac atcttcctta 180gagccagcga190引物序列为1.5’-cgctggctctaaggaagatg-3’2.5’-tcttcaatgcgatgcttacg-3’
2.一段阴道加德纳氏杆菌DNA序列(4)特异性的应用，其特征在于该序列用于诊断阴道加德纳氏杆菌的基因芯片的探针序列，并通过上述的引物序列进行PCR扩增，标记后进行杂交检测或直接用于PCR诊断。
全文摘要
本发明涉及一段阴道加德纳氏杆菌DNA序列(4)特异性的确定及其应用，属于生物医学技术领域。本发明通过基因数据库资料的搜寻和分析，确定了一段阴道加德纳氏杆菌DNA序列(4)的特异性及PCR扩增引物，该序列长度为190bp。通过对妇女生殖道阴道加德纳氏杆菌感染标本的PCR扩增、克隆，获得该序列，测序证明与预计序列一致。再经生物信息学方法分析，基因芯片杂交分析，结果证实了该序列对于阴道加德纳氏杆菌的特异性。本发明作为基因芯片诊断的探针及PCR扩增检测序列，用于阴道加德纳氏杆菌的诊断。用本发明建立的临床检测技术所使用的方法具有快速、准确、操作简便、成本低等优点。
文档编号C07H21/04GK1495269SQ02133410
公开日2004年5月12日 申请日期2002年7月2日 优先权日2002年7月2日
发明者谭德勇, 朱宝生 申请人:昆明寰基生物芯片开发有限公司