一种用于眼部给药预防布氏杆菌病的疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于眼部给药预防布氏杆菌病的疫苗，属于兽用生物制品领域。
【背景技术】
[0002] 布氏杆菌病又名布鲁氏菌病，是由布氏杆菌，又称布鲁氏菌（Brucella abortus) 引起的人畜共患传染病。以母畜流产、不孕和公畜睾丸炎为特征。0IE将其列为B类疫病。 布氏杆菌病广泛地分布于世界各地，能侵害多种家畜、野生动物和人类。布氏杆菌具有宿主 广泛、传染性强以及感染后根治困难等特点，对畜牧业和人类健康均构成严重威胁。人感染 布氏杆菌后，需要长时间的抗生素治疗，而且往往会留下严重的后遗症。在布氏杆菌病流行 的国家，消除布病一直是公共健康计划中最重要的目标之一（丁家波、毛开荣等.布氏杆菌 病疫苗的的应用和研究现状.微生物学报，2006,46(5) :856-859)。
[0003] 疫苗免疫是预防和控制布氏杆菌病的主要措施。尽管布氏菌弱毒疫苗在布氏菌病 防控中发挥了重要作用，但存在皮下免疫不安全和干扰诊断等缺陷，并且在非疫区和种畜、 孕畜、泌乳牛上禁止免疫，限制了疫苗的应用范围。
[0004] 目前，商品化的布氏菌病活疫苗包括布氏菌病活疫苗（A19株）等几个产品，常用 于布氏杆菌病的免疫预防，虽然能够一定程度的抵御布氏杆菌病，但存在部分缺陷。首先， 疫苗的注射容易引起孕畜的应激，从而导致流产；其次，注射免疫的动物体内会长时间保持 较高水平的抗体，由于对布氏杆菌病感染情况的评价是通过抗体检测来实现的，从而影响 免疫后期的疾病诊断；另外，泌乳牛皮下注射布氏杆菌活疫苗后，能够在乳汁中排菌。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于眼部给药的布氏杆菌病活疫苗，从而解决布氏杆菌 病活疫苗常规皮下注射免疫方式导致牛产生持续抗体、引起怀孕牛流产、泌乳牛乳汁中排 菌的问题。
[0006] 本发明的技术方案：
[0007] 1.-种用于眼部给药预防布氏杆菌病的疫苗，其特征在于：
[0008] (1)该疫苗主要含有布氏杆菌弱毒菌株；
[0009] (2)眼部给药的免疫剂量为每头份1 X 10s~9 X 10 9个活的布氏杆菌。
[0010] 2.该疫苗所用的布氏杆菌弱毒菌株可以为布氏杆菌A19株。
[0011] 3.该疫苗所用的疫苗稀释液中可以含有颜色指示剂，用于区别不同免疫动物；
[0012] 4.该疫苗的使用方法为可以眼部给药一次，也可以眼部给药一次后4~6个月后 再眼部给药一次，也可以皮下注射一次后4~6个月后再眼部给药一次。
【具体实施方式】
[0013] 1?疫苗制备和检验
[0014] 本发明所述的疫苗为布鲁氏菌活疫苗，系用牛种布鲁氏菌弱毒菌株A19接种于适 宜培养基培养后收获培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥后即成。
[0015] 成品检验
[0016] 性状：微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
[0017] 纯粹检验：按中华人民共和国兽药典（中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽 药典三部二〇一〇年版，中国农业出版社，2010,本发明以下称《中国兽药典》）附录42页进 行检验，应纯粹。
[0018] 变异检验：取样，将疫苗适当稀释后接种胰蛋白脲琼脂平板，在37°C培养至少72 小时，用布氏菌菌落结晶紫染色法（《中国兽药典》附录8页）检查，粗糙型菌落不得超过 5. 0%〇
[0019] 活菌计数：按瓶签注明头份，将疫苗用蛋白胨水稀释，接种胰蛋白琼脂平板进行活 菌计数（《中国兽药典》附录19页），每头份含活菌数应不少于6X K^CFU。
[0020] 安全检验：按瓶签注明头份，将疫苗稀释成每1. 0ml含1/60头份，皮下注射体重 18~20g小鼠5只，各0. 25ml，观察6日，应全部健活。
[0021] 剩余水分测定：按《中国兽药典》附录38页进行测定，应符合规定。
[0022] 真空度测定：按《中国兽药典》附录48页进行测定，应符合规定。
[0023] 2.布氏杆菌疫苗稀释液
[0024] 本发明所述用于眼部给药免疫的的稀释液含有颜色指示剂，分为蓝色或红色或黄 色或棕色等不同色系指示剂，用以但不仅限于区别疫苗或不同免疫动物或不同时期（年 龄）动物，并且指示疫苗质量状况及免疫操作效果；该稀释液可以是生理盐水或磷酸盐缓 冲液或其他配方稀释液。
[0025] 3?使用剂量
[0026] 眼部给药剂量为每头份1 X 10s~9 X 109个活的布氏杆菌。
[0027] 4.稀释冻干的布氏杆菌病活疫苗后，对牛进行滴眼免疫。疫苗使用方法如下：
[0028](1)按照说明书头份剂量，使用无菌注射器吸取稀释液，将稀释液注入疫苗瓶中， 等疫苗溶解后混匀。取下疫苗瓶盖，套上专用滴眼器。将疫苗滴流出动物眼眶为免疫成功；
[0029] 5?免疫程序为：
[0030] (1)眼部免疫一头份；
[0031] (2)眼部免疫一头份，间隔3~8个月同样方法加强免疫一头份；
[0032] (3)皮下注射一个标准剂量（6X 101(]~8X 10 1(]个菌），间隔3~8个月眼部免疫 一头份；
[0033] (4)眼部免疫一个剂量，间隔3~8个月，皮下注射一个标准剂量（6X 101()~
[0034] 6.免疫效果监测
[0035] 免疫前采血、免疫后每周采血（头1个月）、每个月采血。试管凝集试验（Serum Tube Agglutination Test，TAT)和补体结合试验（Complement Fixation Test，CFT)检测 抗体反应。
[0036] 7?应用方式
[0037](1)取布氏杆菌病活疫苗（A19株），用含有颜色指示剂的稀释液进行稀释，悬浮均 匀；
[0038] (2)稀释后的疫苗每头份含1X108~9X10 9个活的布氏杆菌；
[0039] (3)使用滴眼器或注射器对牛的左眼（或右眼）进行滴眼免疫；
[0040] (4)根据免疫动物健康状况，免疫程序采用如下不同方法：1)眼部免疫一个剂量； 2)眼部免疫一个剂量，间隔3~8个月同样方法加强免疫一个剂量；3)皮下注射一个标准 剂量，间隔3~8个月眼部免疫一个剂量。4)眼部免疫一个剂量，间隔3~8个月，皮下注 射一个标准剂量。
[0041] 本发明涉及的微生物菌种
[0042] 本发明涉及到的布氏杆菌（Brucella abortus)A19株，中国兽医药品监察所1957 年由前苏联兽药监察所获得，原编号为S19,现保藏于北京市海淀区中关村南大街8号中国 兽医药品监察所中国兽