专利名称：一种生产鸭疫里氏杆菌疫苗用菌液的方法
技术领域：
本发明涉及兽用生物制剂技术领域，特别涉及一种生产鸭疫里氏杆菌疫苗用菌液 的方法。
背景技术：
鸭传染性浆膜炎是发生于家鸭、鹅、火鸡和多种禽类的一种接触性传染病，又称鸭 疫里默氏杆菌病、鸭疫巴氏杆菌病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫败血症和新鸭病，其病原为 鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)。该病呈急性败血症或慢性感染，临床 上主要表现为咳嗽、喘气、下痢、眼鼻分泌物增多、共济失调和头颈震颤，少数慢性病例出现 头颈歪斜等症状；典型病变为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎和干酪性输卵管炎。 该病一年四季均可发生，以冬季发病严重，主要经污染的饲料、饮水、飞沫等传播；1-8周龄 的鸭高度敏感，尤以2-3周龄的雏鸭发病率较高，可达90% ；死亡率受多种因素的影响，差 别较大，常为10-20%，但也有的高达60-75%。应激因素如饲养密度过大、通风不畅、卫生 条件差、气候突变等，可诱发该病的发生，死亡率大大提高；耐过鸭可表现神经症状，生长发 育缓慢、消瘦，饲料报酬下降，严重影响生产成绩，造成严重的经济损失。鸭传染性浆膜炎是目前对世界各国养鸭业造成危害最为严重的传染病之一，在世 界范围内分布，几乎在所有采用集约化养鸭生产的国家都有发现，给世界养鸭业造成了巨 大的经济损失。我国是一个养鸭大国，养鸭业在我国的农业经济中占有着重要的地位，也是 人们生活所需肉蛋的重要来源之一，鸭传染性浆膜炎在我国各养鸭地区的流行较严重，是 我国养鸭场(特别是商品鸭场)最难于对付、造成养鸭业经济损失的最主要传染病之一，加 之RA的耐药性逐渐增强，给我国养鸭业造成了巨大经济损失。由于RA病给养鸭业带来严重的经济损失，有关其免疫预防研究引起了越来越多 的关注。尽管RA血清型较多，各型之间基本无交叉保护作用，给疫苗的研制带来了较大的 困难，但关于RA疫苗的研究，还是引起了兽用生物制品领域科研人员的广泛关注并认为鸭 疫里默氏菌预防的根本措施还是接种疫苗。目前研究报道的RA疫苗主要有RA灭活疫苗 (只有一种血清型的单价灭活疫苗、含多种血清型的多价灭活疫苗)、RA和E. coli 二联灭 活疫苗、RA弱毒活疫苗、提取获得RA亚单位成分的亚单位疫苗。其中灭活疫苗效果确实， 就目前研究进展来说是鸭疫里默氏菌预防最好的选择。大规模发酵生产鸭疫里默氏菌菌液 是鸭疫里氏杆菌灭活疫苗生产的基础和关键之一，但目前未有工厂化大规模发酵生产鸭疫 里氏杆菌灭活疫苗菌液的发酵工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产鸭疫里氏杆菌疫苗用菌液的方法，特别涉及工厂 化大规模发酵生产鸭疫里氏杆菌菌液的工艺。本发明采用以下技术方案—种生产鸭疫里氏杆菌疫苗用菌液的方法，包括一级种子的繁殖与鉴定、二级种子的繁殖、发酵；所述的一级种子的繁殖与鉴定为将冻干基础菌种接入含10%犊牛血清 的营养肉汤，37°C培养24小时；然后划线接种在含10%犊牛血清营养琼脂平板上，在含 5 10% CO2或者烛缸的环境中，经37°C、24 48小时培养后选典型菌落接种含10%犊牛 血清营养琼脂斜面若干支，置37°C、5-10% C02或者烛缸环境下培养24小时，作为一级种 子；所述的二级种子繁殖为取一级种子接种于含10%犊牛血清的营养肉汤，置37°C培养 24小时，取样作纯粹检验合格后，置2 8°C保存，使用期不得超过5日；所述的发酵，发酵 所用的培养基为含裂解全血的N-J合成培养基；发酵的菌种接种量为按培养基量的 2%接种二级种子液；发酵方式为培养罐液体发酵培养；培养条件为37°C连续培养24小 时。所述的生产鸭疫里氏杆菌疫苗用菌液的方法，所述含裂解全血的N-J合成培 养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的组分及比例为胰蛋白胨，1.5-1. 9% ；酵 母提取物，0. 2-0. 7% ；牛肉浸膏，0. 2-0. 7% ；水解乳蛋白，0. 2-0. 7% ；葡萄糖，0. 1-0. 4% ； NaCl,0. 5% ；磷酸二氢钾，0. 1-0. 7% ；磷酸氢二钾，0. 1-0. 7% ；Na2HP04 · 12Η20，0· 5-0. 9% ； (NH4)2S04，0. 1-0.2% ；NH4C1,0. 01-0. 03% ；其中所述各组分的百分比为重量/体积百分 比；所述添加物为采用颈静脉采血或颈动脉放血的方法无菌采取非疫区健壮牛血并无菌脱 纤，于-20°C和室温冻融，反复冻融3次后，保存于-20°C备用或采血并无菌脱纤后直接保存 于-20°C，使用前取出反复冻融3次；裂解血球全血按体积比加入基础培养基中。本发明的工厂化大规模发酵生产鸭疫里氏杆菌的工艺已经实验室检测、中试和生 产应用，表明具有良好的效果。
具体实施例方式以下结合附图
和具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例11 %裂解血球全血N-J合成培养基制备配置IOOml的裂解血球全血N-J合成培养基胰蛋白胨1.9g ；酵母提取物 0. 7g;牛肉浸膏0. 7g;水解乳蛋白0. 7g;葡萄糖0. 4g ；NaCl 0. 5g ；磷酸二氢钾0. 3g ； 磷酸氢二钾0. 3g ；Na2HPO4 · 12H20 0. 9g ； (NH4)2SO4 0. 2g ；NH4Cl 0. 03g ；水加至 IOOmL ；将 上述各组分121°C灭菌15分钟，待灭菌成分冷却至低于40°C时，然后向上述基础培养基中 加入添加物裂解血球全血Iml ；摇勻后即得成品N-J合成培养基。所述添加物裂解血球全血为采用颈静脉采血或颈动脉放血的方法无菌采取非疫 区健壮牛血并无菌脱纤，于-20°C和室温冻融，反复冻融3次后，保存于-20°C备用或采血并 无菌脱纤后直接保存于-20°C，使用前取出反复冻融3次制得。实施例2鸭传染性浆膜炎灭活疫苗制苗菌液的制备1菌种血清I型鸭疫里默氏杆菌RA-CH-I株。2培养基 裂解血球全血N-J合成培养基、10%血清营养琼脂平板、裂解全血 及检验用培养基均严格按《中国兽药典》附录进行生产和检验合格后备用。3 方法3. 1 一级种子的繁殖与鉴定
将冻干的血清I型鸭疫里默氏杆菌RA-CH-I株基础菌种接入5ml含10%犊牛血清 的营养肉汤中，37°C培养24小时；然后划线接种在2个含10%犊牛血清营养琼脂平板上， 按标准表面光滑、稍突起、圆形、呈奶油状的菌落，菌落直径1. 2 1. 7mm ；菌涂片可见到菌 体呈单个(偶见成对或呈丝状)，大小为0. 2 0. 4X 15 μ m。选典型菌落接种含10%犊牛 血清营养琼脂斜面5支，置37°C，5-10% CO2 (或者烛缸)环境下培养24小时，保存于4°C 冰箱中(不超过7日)作为一级种子。3. 2 二级种子繁殖取一级种子3支，每支用2_3ml营养肉汤洗下，合并接种于350ml含10%犊牛血 清的营养肉汤，置37°C培养24小时，取样作纯粹检验合格后，保存于4°C冰箱中(不超过5 日)作为一级种子。3. 3制苗用菌液培养采用培养罐培养，在20L发酵罐中装入15L的N-J合成培养基及适量消沫剂，灭菌 后按培养基量的2%接种二级种子液300ml，同时按比例加入裂解血球全血150ml，于 37°C培养24小时。3. 4纯粹检验菌液培养完成后，取样用10%犊牛血清营养琼脂平板作纯粹检验，应纯粹。3. 5菌数测定将菌液定量取样离心后，用生理盐水连续离心洗涤3次并作适当稀释，于紫外 分光光度计下测定560nm处OD值，根据公式含菌总数(CFU/ml) = OD560nm值X稀释倍 数X 2 X 109CFU/ml计算出菌液含菌量，每1. OOml含活菌不低于3. 00 X IO10CFU,计数结果作 为配苗时参考。4 结果取发酵菌液1ml，以3000 5000转/分钟离心5_10分钟后，用生理盐水连续 离心(3000 5000转/分钟，5-10分钟)洗涤3次；用生理盐水50ml溶解和稀释沉淀 (即50倍稀释)；于紫外分光光度计下测定560nm处OD值(用生理盐水调0)，测得OD560nm 为0. 589 ；根据公式含菌总数(CFU/ml) = OD560nm值X稀释倍数X2X 109CFU/ml = 0. 589 X 50 X 2 X 109CFU/ml = 5· 89 X 1010CFU/ml。即每毫升该发酵液中鸭疫里默氏杆菌的含菌数为589亿个。根据该计数结果，发酵液即可用于鸭传染性浆膜炎灭活疫苗制苗用的菌液，经灭 活、乳化等最后制成鸭传染性浆膜炎灭活疫苗。实施例3实验室试制生产了 5批共10. 8万毫升实验室制疫苗，批号分别为2005001、 2005002、2005003、2005004、2005005。疫苗生产过程中，严格按半成品和成品检验规定进行 检验，半成品生产和检验报告结果见表1，成品质量检验情况见表2(5批实验室试制产品成 品的原始检验报告详见后)。表1鸭传染性浆膜炎灭活疫苗半成品生产和检验结果
权利要求
一种生产鸭疫里氏杆菌疫苗用菌液的方法，其特征在于，包括一级种子的繁殖与鉴定、二级种子的繁殖、发酵；所述的一级种子的繁殖与鉴定为将冻干基础菌种接入含10％犊牛血清的营养肉汤，37℃培养24小时；然后划线接种在含10％犊牛血清营养琼脂平板上，在含5～10％CO2或者烛缸的环境中，经37℃、24～48小时培养后选典型菌落接种含10％犊牛血清营养琼脂斜面若干支，置37℃，5 10％CO2或者烛缸环境下培养24小时，作为一级种子；所述的二级种子繁殖为取一级种子接种于含10％犊牛血清的营养肉汤，置37℃培养24小时，取样作纯粹检验合格后，置2～8℃保存，使用期不得超过5日；所述的发酵，发酵所用的培养基为含1％裂解全血的N J合成培养基；发酵的菌种接种量为按培养基量的2％接种二级种子液；发酵方式为培养罐液体发酵培养；培养条件为37℃连续培养24小时。
2.根据权利要求1所述的生产鸭疫里氏杆菌疫苗用菌液的方法，其特征在于，所述 含1 %裂解全血的N-J合成培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基的组分及 比例为胰蛋白胨，1.5-1. 9% ；酵母提取物，0. 2-0.7% ；牛肉浸膏，0. 2-0. 7 % ；水解乳蛋 白，0. 2-0. 7 % ；葡萄糖，0. 1-0.4% ；NaCl,0.5% ；磷酸二氢钾，0. 1-0. 7 % ；磷酸氢二钾， 0. 1-0. 7% ；Na2HPO4 · 12Η20，0· 5-0. 9% ； (NH4)2SO4jO. 1-0. 2% ；NH4Cl,0. 01-0. 03% ；其中所述 各组分的百分比为重量/体积百分比；所述添加物为采用颈静脉采血或颈动脉放血的方法 无菌采取非疫区健壮牛血并无菌脱纤，于-20°C和室温冻融，反复冻融3次后，保存于-20°C 备用或采血并无菌脱纤后直接保存于-20°C，使用前取出反复冻融3次；裂解血球全血按体 积比加入基础培养基中。
全文摘要
本发明公开了一种生产鸭疫里氏杆菌疫苗用菌液的方法，包括一级种子的繁殖与鉴定、二级种子的繁殖、发酵；所述的一级种子的繁殖与鉴定为将冻干基础菌种接入含10％犊牛血清的营养肉汤，37℃培养24小时；然后划线接种在含10％犊牛血清营养琼脂平板上，在含5～10％CO2或者烛缸的环境中，经37℃、24～48小时培养后选典型菌落接种含10％犊牛血清营养琼脂斜面若干支，置37℃、5-10％CO2或者烛缸环境下培养24小时，作为一级种子；所述的二级种子繁殖为取一级种子接种于含10％犊牛血清的营养肉汤，置37℃培养24小时，取样作纯粹检验合格后，置2～8℃保存，使用期不得超过5日；所述的发酵，发酵所用的培养基为含1％裂解全血的N-J合成培养基；发酵的菌种接种量为按培养基量的2％接种二级种子液；发酵方式为培养罐液体发酵培养；培养条件为37℃连续培养24小时。
文档编号C12R1/01GK101967458SQ201010502308
公开日2011年2月9日 申请日期2010年10月11日 优先权日2010年10月11日
发明者朱德康, 汪铭书, 程安春, 陈孝跃 申请人:四川农业大学实验动物工程技术中心