鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，特别涉及一种鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的 试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA)是一种革兰氏阴性菌，归于黄 杆菌科（Flavobacteriaceae)，是鸭疫里默氏菌病的病原体，能够引起鸭、鹅、火鸡和多种禽 类的一种慢性或急性败血症状的接触性传染疾病，呈世界性分布，发病率和死亡率高，已成 为目前严重危害养鸭业的主要传染病之一。临床症状主要表现为精神沉郁，瘫地、缩颈、拉 黄绿色稀便等症状。该病主要的病变特征是引起宿主的纤维素性气囊炎、脑膜炎、心包炎、 肝周炎、以及干酪性输卵管炎，并伴有不同程度的败血症，对养殖业的发展存在着巨大的威 胁。
[0003] 目前已建立的用于检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的方法有琼脂扩散试验、凝集试 验、全菌的ELISA试验、PCR检测等。这些方法在检测方面都存在诸多不足之处。如琼扩试 验和凝集试验的灵敏度较低，特异性不高，只能检测个别血清；PCR检测虽然灵敏但是在实 际的生产当中运用难度大，需要专业的仪器和人员；破碎全菌的ELISA方法虽然彰显了在 ELISA检测方面的优势，但是作为包被抗原，在制备菌体抗原时细菌培养要求高且在菌体抗 原成分复杂、特异性等方面存在不足。
[0004] OmpH属于孔蛋白，目前未见鸭疫里默氏杆菌OmpH研宄和应用的相关研宄报道。
【发明内容】
[0005] 为克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的目的之一在于提供鸭疫里默氏杆 菌OmpH截段重组蛋白的应用，该应用为鸭疫里默氏杆菌的抗体检测提供了新思路。为实现 上述目的，本发明的技术方案为：鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白在制备鸭疫里默氏杆 菌抗体的诊断试剂中的应用，鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种ELISA试剂盒，其用于检测鸭疫里默氏杆菌抗体 有着较高的敏感性、特异性和重复性。
[0007] 本发明的目的之三在于提供一种非诊断目的的鸭疫里默氏杆菌抗体的检测方法， 该方法操作简单，适用于大规模应用。
[0008] 为实现上述方案，本发明的技术方案为：
[0009] 一种鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的试剂盒，其包括固相支持物、抗体捕获 剂、酶标二抗、底物、封闭液、终止液，其特征在于：所述抗体捕获剂为如SEQ ID NO: 1所示的 鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白。
[0010] 所述的试剂盒为ELISA试剂盒。
[0011] 所述的试剂盒中抗体捕获剂为浓度多4 y g/mL的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组 蛋白。
[0012] 所述的试剂盒中酶标二抗为作400倍体积稀释的羊抗鸭IgG-HRP。
[0013] 所述的封闭液为1% BSA。
[0014] -种鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白在制备鸭疫里默氏杆菌抗体的诊断试剂 中的应用，所述的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0015] 所述的应用的检测方法，包括如下步骤：
[0016] A)将鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白与固相支持物连接，用封闭液封闭，洗涤 去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；
[0017] B)将待检血清通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固 相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；
[0018] C)将所述酶标二抗与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原一抗体一二抗复合 物；
[0019] D)在步骤C所得抗原一抗体一二抗复合物加入TMB底物显色液避光显色后，加入 2mo 1 /LH2S04终止液终止反应得显色样品液；
[0020] E)将步骤D所述显色样品液用酶标仪测0D450nm值，待检血清的0D450nm值> 阴性样品〇D450nm值的临界值X+3SD时判定为阳性，反之则为阴性，其中X为阴性样品 0D450nm值的均值，SD为阴性样品0D450nm值的标准方差。
[0021] 所述的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的试剂盒的诊断方法，所述的ELISA试 剂盒检测鸭疫里默氏杆菌抗体的方法具体为：
[0022] A、将浓度彡4 y g/mL的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白与固相支持物连接，用 1% BSA封闭液封闭，洗涤去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；
[0023] B、将待检血清作200倍稀释得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与步骤A 所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗涤去除固相载体上杂质；
[0024] C、将羊抗鸭IgG-HRP作400倍体积稀释的后与所述固相抗原抗体复合物结合，得 抗原一抗体一二抗复合物；
[0025] D、在步骤C所得抗原一抗体一二抗复合物加入底物TMB显色液避光显色后，加入 2mo 1 /LH2S04终止液终止反应得显色样品液；
[0026] E、将步骤D所述显色样品液用酶标仪测0D450nm值，待检血清的0D450nm值> 〇. 35时则为阳性，反之则为阴性。
[0027] 步骤A中所述鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白、步骤B中所述稀释血清及步骤 C中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积。
[0028] 步骤A中所述鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白与固相支持物连接的时间为4°C 包被过夜；
[0029] 步骤B中稀释血清的保温反应时间和步骤C中酶标二抗的结合时间均为120min ;
[0030] 步骤D中的TMB底物显色时间为10min。
[0031] 本发明的有益效果在于：鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白是选取鸭疫里默氏 杆菌（RA)〇mpH基因编码蛋白的主要抗原域（81aa-151aa)，并命名为OmpHM;然后利用基因 工程技术，在对OmpH截段基因克隆的基础上，将其与原核表达载体pET-32a(+)连接，成功 转化大肠杆菌BL21(DE3)表达系统进行诱导、表达的基因工程产品。该蛋白的表达形式是 OmpHM/His可溶性融合蛋白，表达的融合蛋白分子量为28kDa，将产品设计为融合表达主要 考虑是便于纯化；同时表达蛋白为可溶性表达形式，在蛋白的制备、纯化过程中避免了蛋白 的变性、复性等过程，利于保持蛋白的天然活性。经原核表达系统表达后的产品经Western blot进行鉴定后表面具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。本发明运用纯化后的OmpHM/ His融合蛋白作为包被抗原，建立了 ELISA检测试剂盒，该方法可用于几种不同血清型之间 的检测，具有重复性好、敏感性强、特异性高等特点。
[0032] 采用本发明的方法生产的产品可用于：
[0033] ①本产品中OmpH截段重组蛋白可作为检测鸭疫里默氏杆菌抗体的间接ELISA方 法中的检测抗原。
[0034] ②本产品中间接ELISA试剂盒可用于临床鸭血清样本鸭疫里默氏杆菌抗体的检 测。
[0035] 本发明的产品优点体现在：
[0036] ①由于该检测抗原是鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白，并非全菌，因此应用该 检测抗原进行检测时无散毒危险。
[0037] ②本发明可以用于鸭疫里默氏杆菌RA-ATCC 11845、RA-CH-1和RA-CH-2不同血清 型的抗体检测。
[0038] ③检测鸭疫里默氏杆菌抗体，特异性强，重复性好，灵敏度高。无交叉反应。
[0039] ④性能稳定、生产成本低，适合工厂化生产，市场应用前景广。
【附图说明】
[0040] 图1为OmpH截段基因的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。其中1为OmpH截段基因 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的特异性DNA条带；M为DNA Marker。
[0041] 图2为重组质粒pMD19-〇mpHM的琼脂糖凝胶电泳图。其中M为DNAMarker ; 1为 重组质粒pMD19-〇mpHM用BamH I和XhoI双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的 两条特异性条带。
[0042] 图3为重组质粒pET32a-〇mpHM的酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。其中M为DNA Marker ; 1为重组表达质粒pET32a-〇mpHM用Xho I单酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所 获得的一条特异性条带；2为重组表达质粒pET32a-〇mpHM用BamH I和Xho I双酶切，酶 切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带；3为重组表达质粒pET32a-〇mpHM用 BamH I单酶切。
[0043] 图4为在37°C下，IPTG =0.4mmol/L时诱导表达过夜的OmpH截段重组蛋白的 SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白质Marker ; 1为空载体pET-32a(+)用IPTG诱导后经 SDS-PAGE电泳所得结果；2为重组表达质粒pET32a-〇mpHM用IPTG诱导，得到的菌液进行超 声波破碎、离心后，所得上清进行SDS-PAGE电泳的结果；3为重组表达质粒pET32a-〇mpHM 用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得沉淀进行SDS-PAGE电泳的结果。
[0044] 图5为37°C时不同IPTG浓度下含有重组质粒pET32a-〇mpHM的宿主菌E. coli BL21(DE3)诱导表达4小时后，鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。其 中M为蛋白质Marker ;1为IPTG的终浓度为0mmol/L ;2为IPTG的终浓度为0. 4mmol/L ;3 为IPTG的终浓度为0? 8mmol/L ;4为IPTG的终浓度为1. 2mmol/L。
[0045] 图6为不同温度下，IPTG=0. 4mmol/L时含有重组质粒pET32a-〇mpHM的宿主菌 E. coli BL21 (DE3)表达鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白诱导表达4小时的SDS-PAGE电 泳图。其中M为蛋白质Marker ;1为诱导温度为25°C ;2为诱导温度为30°C ;3为诱导温度 为37。。。
[0046] 图7为37 °C和IPTG浓度为0. 4mmol/L时不同诱导时间下含有重组质粒 pET32a-〇mpHM的宿主菌E. coli BL21(DE3)表达鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的 SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白质Marker ;1为诱导Oh;2为诱导5h;3为诱导7h，4为诱 导9h。
[0047] 图8为镍琼脂糖凝胶（Ni2+-NAT)亲和层析纯化后的鸭疫里默