鹿茸dna鉴定试剂盒及鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及使用生物技术快速鉴定鹿茸(梅花鹿和马鹿)与其易混品种DNA鉴定试剂盒及鉴定方法。
【背景技术】
[0002]鹿茸为脊索动物门哺乳纲鹿科动物中雄鹿密生绒毛的幼角，我国有鹿科动物9属16种，每个种又有不同的亚种，《中华人民共和国药典》(2010年版)中规定仅梅花鹿(Cervusnippon)和马鹿(Cervus elaphus)的鹿鸾为正品药材。梅花鹿鸾主要产于吉林、辽宁等省，马鹿茸主要产于黑龙江、吉林、内蒙古、新疆、云南、甘肃等地。
[0003]鹿茸中的化学成分比较复杂，含氨基酸19种以上、磷脂成分10种、脂肪酸9种、糖月旨、糖，固醇类、激素样物质、前列腺素、脑素、核糖核酸、去氧核糖核酸、三磷酸腺苷、硫酸软骨素、多胺、肽类、脂蛋白、维生素、酶类及各种微量元素等，其中明显有药理活性的组分主要是蛋白多肽类、留体类和多胺类化合物。丰富的成分使鹿茸的药用价值很高，鹿茸入药已有2000多年的历史，始载于汉代的《神农本草经》。其后在历代本草中对鹿茸的药用均有收载，《本草纲目》记载:“生精补髓，养血益阴，强健筋骨。性味甘、咸、温。主治虚劳赢瘦、腰膝酸痛、心悸耳鸣、阳萎滑精、子宫虚冷、崩温带下等症”，现代药理学研究表明，鹿茸具有增强机体免疫、抗衰老、加速创伤愈合、促进骨质修复等功能。
[0004]鹿茸作为贵重药材，产源不足但需求量增加，使得不同渠道来源的伪品、混淆品和代用品在国内的药源市场屡见不鲜，如用蛋清、色素、骨块和动物毛皮加工成为伪品鹿茸片；未收入国家标准的驯鹿、豚鹿、爪哇鹿、坡鹿、鲇鹿、驼鹿、麋鹿、狍等的茸也进入商品市场，致使鹿茸商品来源复杂，药材市场极为混乱。这种伪品鹿茸的价格依旧昂贵却完全失去有效成分和药用效果，不仅延误病人的救治，而且降低人们对中药的信任，严重影响我国传统药学的发展，更制约着中国传统医药的规范化、标准化和国际化。
[0005]常用的鉴定鹿茸方法有性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定等。性状鉴别主要是指从鹿茸的外观形态、气、味、色泽、质地以及断面的感观特征进行综合分析，方法简单，但经验在这种方法中的影响很大，主观性较强。即使进行了很详细的性状描述，再由其他人来判断也比较难。而且作为药材形态通常是不完整的，因此鉴定难度较大(常丽静等.梅花鹿鹿茸品质评定等级[J].吉林农业，2011，262 (12):204)。显微鉴定是利用显微镜观察药材的内部组织构造、细胞形态，已经有学者描述了鹿茸的表皮角质层、毛干直径、角化梭形细胞等显微特征，为鹿茸的鉴定提供依据，但这一方法不能揭示细胞内在信息，无法精准鉴别近缘物种(徐国钧等.中药材粉末显微鉴定[M].北京:人民卫生出版社。1993:810)。理化鉴定是利用仪器对其有效成分进行分析，但鹿茸成分复杂，对极易混淆的近缘物种不易区分，难以达到药材质量控制的目的(阎正等.鹿茸的HPLC指纹图谱[J].河北大学学报，2010，30(2):164-170)o
[0006]上述鉴定鹿茸的方法均存在一定的局限性，临床急需建立一套准确、有效、标准的鹿茸药材鉴定方法，实现鹿茸的真伪鉴定，确保药材质量，保障临床用药的安全性与准确性。
[0007]随着现代科学分析技术的发展，DNA分子遗传标记技术在中药材鉴定中经常被使用，这种标记技术具有多态性强、准确性高等优点。利用DNA分子标记技术对中药材鹿茸进行鉴别，直接从遗传物质DNA的核苷酸序列上检测遗传变异。因此，它是区别个体间遗传变异最彻底的分析方法，能提供基因组特异性区域完全的遗传信息。
[0008]鹿科线粒体DNA (mitochrondrial DNA, mtDNA)呈共价闭合环状，包括一条重链、一条轻链，是细胞核外具有自主复制、转录和翻译能力的遗传物质，与核DNA相比，具有分子结构简单、碱基突变率高、母性方式遗传、不同区域进化速度存在差异等特点。正是由于这些特点，使mtDNA成为一种有效的遗传标记，广泛地应用于鹿科动物类群识别、起源与分化、鹿产品鉴定等领域。
[0009]细胞色素b(cytochrome b，Cytb)位于线粒体内膜脂质双分子层中，是参与氧化磷酸化合成ATP过程电子传递链中的重要物质，是线粒体自身编码的为数不多的功能蛋白，其基因的进化速度适中，近年来被广泛应用于系统发育、种类鉴别等的研究。细胞色素C氧化酶亚基1 (cytochrome c oxidase subunit 1，C0I)是线粒体中约650bp的一段序列，它的基因进化速度比Cytb基因更快，因此可以用来区分进化非常紧密的物种。这两个片段的基因可作为动物物种鉴定的标记。
[0010]我们依托吉林省科技厅(2008年1月立项)和吉林省教育厅资助课题(2010年1月立项):《中药DNA指纹检测试剂盒的研究与开发》(2012年5月吉林省科技厅鉴定成果)，基于线粒体DNA建立动物中药材的DNA指纹特征，成功开发出貂心、乌梢蛇中药材DNA鉴定试剂盒(李明成，张丽华等《貂心DNA检测试剂盒及鉴定方法》，发明专利:ZL200810051643.3 ;2011.4授权；张丽华，李明成，王冰梅.貂心线粒体mtDNA鉴定及特征分析[J].中国药学杂志，2008，43(22): 1694-1696 ;于文静，周婷婷，张丽华，等.蕲蛇DNA检测试剂盒的评价及应用[J].中国药学杂志，2014，43(22): 1694-1696，2010，21(4):937-938.)。
[0011]目前用DNA分子标记技术鉴别鹿茸，国内外虽有一些报导，但仍处于理论研究阶段，即使对鹿茸及其伪品DNA指纹技术方面虽有部分研究(张蓉等.鹿茸饮片的DNA条形码鉴别研究.中国药学杂志，2011,49(11): 999-1002.)，但其方法成本高，操作复杂，实际应用有困难。
[0012]课题组从事中药易混品种的鉴定工作多年，运用多重PCR技术已经成功鉴定中药材龟甲(刘桐辉，王锦，李明成.中药材龟甲细胞色素b基因特异性鉴定研究[J].中国药学杂志，2012，47(3): 182-185 ;邓莹，张丽华，李明成.复合聚合酶链反应鉴别龟甲正品与伪品的特征[J].中国药学杂志，2014，49(12): 1022-1026)。在此基础上，采用多重PCR技术进行鹿茸及其伪品的鉴别，解决了临床上难以鉴别鹿茸正品及伪品的难题。
[0013]多重PCR (multiplex PCR，MPCR)技术是 Chamberian 等在 1988 年率先提出的，指在同一反应体系中同时加入几对引物，使几个PCR同时完成。多重PCR可同时扩增多个目的基因，具有特异性强、效率高、成本低的优势，已经被广泛应用(Persson S,Al—Shuweli S, Yapici S, et al.1dentificat1n of clinical Aeromonas species byrpoB/gyrB sequencing and development of multiplex PCR for the detect1n of A.hydrophila, A.caviae, A.veronii and A.media.J Clin Microb1l.2014 Nov 19.pii: JCM.01963-14.)。由于鹿茸型别较多，种间存在较多的变异位点，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等。
[0014]
【发明内容】
[0015]本发明专利采用生物信息学技术对鹿茸线粒体DNA基因组进行筛选，利用Genbank中的相关信息，根据梅花鹿茸与其他相关动物的线粒体DNA序列的差异，选取COX I和CytB基因序列，应用primer premier 5.0设计软件，设计可有效地区分鹿鸾和伪品的特异性DNA序列，利用多重PCR技术在一个反应体系中加入两对特异性引物，针对一个模板可扩增两个具有差异的目的片段。提供一种可鉴定鹿茸与其易混品种的多重PCR鉴定试剂盒，以解决现有技术的缺陷。本方法操作简便、快速有效、结果稳定准确，能够用于鹿茸样品的鉴定。
[0016]本发明的目的是由以下技术方案来实现的:
一种鉴别鹿茸及其伪品的多重PCR检测试剂盒，它包含:
1.DNA提取体系
(1)样本裂解将待检样品用70%酒精清洗3min，37°C烘箱中挥发酒精，用剪刀剪碎至1mm3左右。称取样品0.lg放入离心管中，加入500 μ 1裂解液、15 μ 1蛋白酶K (20mg/ml)和30 μ 110%SDS (十二烷基磺酸钠)，混匀后置于56°C水浴振荡16?18h，转速100 r/min。
[0017](2)沉淀直接向裂解后