卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中il-8表达的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及卷烟烟气毒理研究技术领域，具体涉及一种卷烟烟气中芳香胺类化合 物体外诱导上皮细胞中IL-8表达的检测方法。
【背景技术】
[0002] 慢性阻塞性肺病（chronicobstructivepulmonarydisease，C0PD)是世界范围 内一种发病率高、致残致死率高、且严重影响患者生活质量的疾病，同时会加重患者的经济 负担。
[0003] 在各种致病因素中，吸烟是最重要的环境危险因素。据统计，由吸烟所致死亡的疾 病中，慢性肺部疾患占45 %，C0PD是其中的慢性肺病之一。国外有80 %~90 %的C0PD是 由吸烟引起的，我国约有72%的C0PD是由吸烟引起的。
[0004]大量研究证实，C0PD气道炎症主要由中性粒细胞（PMN)、淋巴细胞和巨噬细胞等 炎症细胞浸润并被激活后释放大量细胞因子和炎性介质所致，其中TNF-α、IL-6、IL-8是 参与C0PD气道炎症的重要细胞因子。
[0005] IL-8主要由单核-巨噬和气道上皮细胞产生，具有激活PMN的细胞因子，可使PMN 趋化、脱颗粒进而释放溶酶体酶，并能促进T细胞趋化、游走，增强免疫应答，在疾病发生、 发展中起重要作用。
[0006]目前已有研究发现，应用动物或人的气道上皮细胞，采用卷烟提取物或全烟气暴 露模型均发现能显著诱导气道上皮细胞中IL-8的表达，比较吸烟者和非吸烟者肺组织及 血液中IL-8的表达量发现二者具有显著差异。
[0007] 卷烟烟气是多种化合物组成的复杂混合物，截止1988年（据Roberts， 1988TobaccoR印orter报道）已经鉴定出烟气中的化学成分达5068种，其中1172种是烟 草本身就有的，另外3896种是烟气中独有的。美国健康基金会副董事长D.霍夫曼博士列 出卷烟烟气中的44种主要有害成分，除焦油、烟碱和一氧化碳这些主要成分外，其他大致 可分为九类：①氨；②四种芳香胺③苯并芘；④八种醛酮类化合物；⑤氢氰酸；⑥七种无机 元素；⑦七种酚类化合物；⑧四种烟草特有亚硝胺；⑨其他挥发性有机成分。
[0008] 芳香胺类物质具有一定的致癌作用，目前尚无芳香胺类物质对肺部炎症的相关系 统研究。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-8表达的 检测方法，操作简单，方便快速，灵敏度高，能够准确检测卷烟主流烟气中各种芳香胺类物 质对人气道上皮细胞中IL-8表达的诱导作用。
[0010] -种卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-8表达的检测方法，包 括：
[0011] 步骤1，以pGL6为质粒载体，构建含有IL-8启动子的IL-8-promotor-pGL6质粒；
[0012] 步骤2,将IL-8-promotor-pGL6质粒转染入人气道上皮细胞16HBE中，得到 IL-8-promotor-pGL6-16HBE细胞；
[0013] 步骤3,在IL-8-promotor-pGL6-16HBE细胞中加入卷烟烟气中的芳香胺类化合 物，作用至少48h;
[0014] 步骤4,对步骤3的作用产物进行荧光素酶活性检测，依据所得的荧光素酶活性， 得到上皮细胞中IL-8的诱导表达倍数。
[0015] 本发明选取人气道上皮细胞中IL-8启动子序列-1475-+1作为靶标序列，利用PCR 扩增该序列，并克隆到具有荧光素酶报告基因和G418筛选标记的PGL6质粒中，将测序验证 正确的质粒转染入人气道上皮细胞16HBE中，将转染后的细胞与卷烟提取物相作用，获得 上皮细胞中IL-8的表达程度。
[0016] 作为优选，IL-8-promotor_pGL6质粒的构建方法如下：
[0017] 步骤1-1、设计IL-8启动子-1475-+1的引物序列如下：
[0018]上游引物为：5'-GCACTCGAGTAACCCAGGCATTATT-3'（序列如SEQIDN0 :1 所示的 DNA序列）；
[0019]下游引物为：5'-GCTAAGCTTAGTGCTCCGGTGGCTTTT-3'（序列如SEQIDN0 :2 所示 的DNA序列）；
[0020] 以人气道上皮细胞16HBE的总基因组DNA为模板，利用PCR扩增IL-8启动子序 列；
[0021] 步骤1-2、利用ΚρηI和XholI双酶切步骤1-1的PCR产物和质粒载体pGL6,用 T4DNA连接酶连接至少24h，得到IL-8-promotor-pGL6质粒。
[0022] 作为优选，步骤1-1中PCR反应的条件如下：
[0023]
[0024] 变性、退火、延伸循环28~30次。
[0025] 作为优选，PCR产物与pGL6载体的摩尔比为3:1。
[0026] 作为优选，利用Lipofectamine3000转染试剂将IL_8-promotor-pGL6质粒转染入 人气道上皮细胞16HBE中，然后采用G418筛选得到IL-8-promotor-pGL6-16HBE细胞。
[0027] 作为优选，步骤3中，芳香胺类化合物的加入量为不对人气道上皮细胞16HBE产生 细胞毒性的最大量。
[0028] 本发明提供的检测方法，具有以下优点：
[0029] (1)由于卷烟烟气进入人体气道后主要作用细胞，本发明采用人气道上皮细胞作 为研究对象，更接近吸烟的实际状态。
[0030] (2)特异性的选取人气道上皮细胞中IL-8的启动子序列，使检测更加具有针对性 和特异性。
[0031] (3)建立IL-8-promotor-PGL6-16HBE稳转细胞，不用反复瞬时转染质粒，使筛选 更加快速和经济。
[0032] (4)采用荧光素酶报告基因作为最终检测指标，灵敏度高。
【附图说明】
[0033] 图la表示1-氨基萘对16HBE的细胞毒作用；
[0034] 图lb表示3-氨基联苯对16HBE的细胞毒作用；
[0035] 图2a表示1-氨基萘对16HBE中IL-8表达的诱导作用；
[0036] 图2b表示3-氨基联苯对16HBE中IL-8表达的诱导作用；
[0037] 图3为PGL6质粒图谱；
[0038] 图4表示卷烟提取物对人气道上皮细胞中IL-8的诱导作用。
【具体实施方式】
[0039] 实施例1
[0040] 芳香胺类物质是卷烟主流烟气中的主要物质之一，主要有如1-氨基萘，2-氨基 萘，1-氨基联苯，3-氨基联苯等。为检测这些芳香胺类物质是否是吸烟导致肺部炎症的主 要化合物，对1-氨基萘和3-氨基联苯是否会诱导人气道上皮细胞中IL-8的表达进行检 测，包括以下步骤：
[0041] 步骤1，以pGL6为质粒载体，构建含有IL-8启动子的IL-8-promotor-pGL6质粒， 构建方法如下：
[0042] 步骤1-1、设计IL-8启动子-1475-+1的引物序列如下：
[0043] 上游引物为：5 ' -GCACTCGAGTAACCCAGGCATTATT-3 ' ；
[0044] 下游引物为：5' -GCTAAGCTTAGTGCTCCGGTGGCTTTT-3' ；
[0045] 以人气道上皮细胞16HBE的总基因组DNA为模板，利用PCR扩增IL-8启动子序列。
[0046] PCR反应体系包括：
[0047] 模板（即16HBE总基因组DNA) 1μ[; 上游引物（ΙΟμΜ) 1.5pL; 下游引物（ΙΟμΜ) 1.5μL; 2xPCRbufferforKODFX 25μL; 2mMdNTPsΙΟμL; K(3DFX(i.0U/,uL) l.uL; Autoclaved,distilledwater 10μL; 总体积
[0048] PCR反应的条件如下：
[0049]
[0050] 将PCR产物利用1%琼脂糖凝胶，110V，20min电泳分离后，得到的扩增条带中的目 的条带约680bp切下，用GelExtractionKitDNA纯化试剂盒进行纯化。
[0051] 步骤1-2、采用ΚρηI和XholI双酶切纯化产物5h，同时采用ΚρηI和XholI双 酶切2μg质粒载体pGL65h，再次纯化回收后，用T4DNA连接酶在16°C下连接24h。
[0052] 连接反应体系如下：
[0053]
[0054] PCR产物与pGL6载体的摩尔比为3:1。
[0055] 步骤1-3、将连接产物转入大肠杆菌DH5a中，125rpm，37°C，培养lh，将转化产 物涂布于含有1