制备毛癣菌扫描电镜样品的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种毛癣菌扫描电镜样品的制备方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 样品的前处理是电镜观察的必备过程，其处理效果的好坏直接关系到电镜观察的 结果。
[0003] 由于毛癣菌的菌丝均呈团状，且有些较厚，在样品处理过程中，存在着与试剂接触 不充分的现象，导致样品处理不均匀，结果无法准确判断。通过多次的重复实验发现，电镜 制样过程中最重要的一步是固定，若是固定效果不好，后续处理也难以起到很好地改善作 用。
[0004] 目前最常用的方法为戊二醛-锇酸（四氧化锇）双重固定，但锇酸是剧毒物品，接 触或吸入可导致头痛、呼吸道炎症、眼病、支气管病、肺炎等，对实验人员的健康构成严重的 潜在威胁，有必要研究一种低毒的固定方法以代替传统的双重固定法。也有研究单用戊二 醛固定，但易使菌体皱缩，难以取得令人满意的效果。
【发明内容】
[0005] 本发明研究了一种毛癣菌扫描电镜（SEM)样品的制备方法，本发明的核心在于： 样品固定时，用戊二醛溶液处理的同时应用超声辅助处理。
[0006] 超声辅助处理是指：将盛有样品和3%戊二醛溶液的容器，如EP管，置于超声清洗 仪中处理一段时间。
[0007] 优选地，戊二醛溶液的浓度为3 %。
[0008] 进一步优选地，本发明的固定步骤为：取样品，加入3%戊二醛溶液，然后用超声 清洗仪清洗超声辅助处理，接着在4°C条件下3%戊二醛溶液过夜处理，进入后续常规处理 步骤。
[0009] 过夜处理为本领域技术人员常用的术语，一般指下午或晚上进行实验操作，然后 继续处理一晚上，到第二天进行下一实验步骤，通常处理时间超过8h。
[0010] 优选地，超声处理的率为60W。
[0011] 优选地，超声处理的时间为60~90s。
[0012] 进一步优选地，超声处理的时间为60s。
[0013] 本发明较佳的固定方法为：取样品，加入3%戊二醛溶液，然后将超声清洗仪功率 调整为60W超声辅助处理60s，接着在4°C条件下3%戊二醛溶液过夜处理，进入后续常规处 理步骤。
[0014] 本发明的方法可用于各种毛癣菌，用于须癣毛癣菌效果为最佳。
[0015] 通常微生物菌丝用于扫描电镜样品的制备包括菌丝活化、样品准备、固定、清洗、 脱水、喷金等各种步骤。
[0016] 本发明集中于解决其中最核心的问题，即样品的固定问题，其他各步骤可参照一 般的样品处理方法。
[0017] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和手段，在不脱离本发 明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。
[0018] 以下通过具体实施例的形式，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不 应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现 的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0019] 图1各不同固定处理SEM观察结果
【具体实施方式】
[0020] 实施例1 :须癣毛癣菌扫描电镜样品的制备
[0021] 1材料与试剂：
[0022] 1. 1 实验材料：须癣毛癣菌（Trichophytonmentagrophytes)
[0023] 1. 2试剂：蛋白胨、葡萄糖、琼脂、pH7. 2的磷酸缓冲液（PBS)、25%戊二醛、乙醇、丙 酮、叔丁醇
[0024] 1. 3主要实验仪器：超净工作台、培养箱、移液器、冰箱、高压灭菌锅、超声清洗仪 (AS3120A，220V，120W，天津奥特赛恩斯仪器有限公司）
[0025] 1.4样品准备
[0026] 1. 4· 1菌丝活化
[0027] SDA平板配制：称取蛋白胨10g、葡萄糖20g、琼脂18g，定容至1L，121°C、灭菌 30min，在培养基凝固之前倒平板，备用；
[0028] 菌种活化：将菌种接种于平板上，在30°C的培养箱中培养5~7天，备用。
[0029] 1. 4. 2样品准备：取活化的菌种接种于无菌的SD培养基（除去SDA培养基中的琼 脂即可）中，30°C的培养箱中培养5~7天，备用。
[0030] 1. 5制样方法：
[0031] (1)取样：取适量同一生长周期的菌丝于2mL的EP管中，用纯水清洗2~3次，除 去菌丝表面的培养基及其它杂质；
[0032] (2)固定：将上述清洗后的菌丝分别按照表1中戊二醛的浓度进行固定处理，A~ E分别加入各自浓度的戊二醛，放到4°C的冰箱过夜即可；F~I按表1中对应的方法处理， 即取样品，加入3%戊二醛溶液，然后用超声清洗仪清洗超声辅助处理相应的时间，接着在 4°C条件下3%戊二醛溶液过夜处理。
[0033] 各组处理方法见表1 :
[0034] 表1各组固定处理步骤
[0035]
[0036] (3)清洗:取出固定后的菌丝，用纯水清洗3次，除去固定液及固定液中的磷酸 盐；
[0037] (4)脱水：依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇脱水15~2011^11，然后 再用100%的乙醇处理三次，30min/次；
[0038] (5)置换：叔丁醇：乙醇=1 : 3、2 : 2、3 : 1分别处理10~15min，l次；然后 用100%的叔丁醇处理三次，第三次叔丁醇处理结束时保存于-20°C冰箱；
[0039] (6)冷冻干燥：待叔丁醇冻至雪花状，即可取出置于预冷的冷冻干燥仪的样品池 中进行冷冻干燥；
[0040] (7)喷金：将干燥的样品取出，用导电胶粘到样品台上，并用吹风机吹掉未粘好的 多余样品，防止将样品台放到电镜样品室中观察时样品掉到电镜中，损坏电镜，然后利用离 子溅射仪对粘好的样品进行喷金；
[0041] (8)观察：将处理完的样品放到SEM中观察，并记录观察结果。
[0042] 2实验结果
[0043] 图中A是未用戊二醛固定的对照组，B、C、D、E分别为用不同浓度的戊二醛固定处 理的样品所观察的结果。由图可见：A中几乎所有的菌丝都处于皱缩状态；B中绝大部分 菌丝为皱缩状态，很小一部分呈饱满状态；C中约有一小半的菌丝很饱满，呈现了其正常状 态，约一大半菌丝出现了皱缩现象；D中菌丝饱满，出现皱缩的比C组要少得多，程度较轻；E 中仅有一小部分菌丝比较饱满，比D中菌丝整体皱缩程度高得的多，且皱缩程度更为严重。
[0044] 由此可见，单用戊二醛溶液固定时，浓度为3%时效果最优，但效果仍然不够理想。
[0045] 图F~I是在用3%戊二醛溶液固定处理并用超声辅助处理的结果，由图F可见， 超声辅助处理15s，仅约有1/4左右的菌丝呈现正常形态；由图G可见，超声辅助处理30s， 约有一小半菌丝呈现正常形态；F和G两者正常形态的菌丝所占比例均比单用3%戊二醛固 定处理（D)的要少得多；由图Η可见，超声辅助处理60s，绝大部分菌丝都呈现正常的饱满 形态；由图I可见，超声辅助处理90s，正常形态的菌丝所占比例和单用3%戊二醛固定处理 的较接近。
[0046] 可见，超声辅助处理60s效果最优。
[0047] 对各组图片中饱满的菌丝进行统计比较，结果见表2 :
[0048] 表2各处理组菌丝正常形态的比例
[0049]
[0050] 由表2统计结果可知，超声辅助处理60s处理结果明显优于其他各组，和单用3% 戊二醛溶液固定相比，菌丝饱满率有了很大的提升。
[0051] 本发明方法没有应用剧毒的锇酸，创新性地应用了超声辅助戊二醛固定处理，固 定效果好，操作简便，安全、毒性小，为毛癣菌的扫描电镜制样提供了一种新的方法。
【主权项】
1. 一种毛癣菌扫描电镜样品的制备方法，其特征在于：样品固定时，用戊二醛溶液处 理的同时应用超声辅助处理。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：戊二醛溶液的浓度为3%。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：固定处理步骤为：取样品，加入3%戊二 醛溶液，然后用超声清洗仪超声辅助处理，接着在4°C条件下3%戊二醛溶液过夜处理，进 入后续常规处理步骤。4. 根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：超声处理的功率为60W。5. 根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：超声处理的时间为60~90s。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：超声处理的时间为60s。7. 根据权利要求1~6任一项所述的方法，其特征在于：所述的毛癣菌为须癣毛癣菌。
【专利摘要】本发明提供了一种毛癣菌扫描电镜样品的制备方法：本发明的核心要点在于：样品固定时，用戊二醛溶液处理的同时应用超声辅助处理。本发明方法没有应用剧毒的锇酸，创新性地应用了超声辅助戊二醛固定处理，固定效果好，操作简便，安全、毒性小，为毛癣菌的扫描电镜制样提供了一种新的方法。
【IPC分类】C12Q1/04, C12R1/645
【公开号】CN105238845
【申请号】CN201510666780
【发明人】白波, 曾智, 胡娜, 索有瑞
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年10月16日