桃潜隐花叶类病毒分子标准样品及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种桃潜隐花叶类病毒分子标准样品及其制备方法，具体包括PLMVd的原料选取、标准样品的制备、均匀性和稳定性检查、定性检定、定值等过程。所述标准样品的制备方法包括：由PLMVd病毒液中提取病毒RNA、RT?PCR反应扩增并纯化目的基因片段、目的片段的连接转化；回收质粒的步骤。本发明的桃潜隐花叶类病毒标准样品稳定性高、均匀性好，适用于对桃潜隐花叶类病毒进行快速检测确证，为桃潜隐花叶类病毒的检测研究、农药研究、应用研究提供了标准样品的需求，可广泛应用于农业生产及环境中的疫情监控及进出口贸易中该类病毒的监测及检测。使用本发明的标准样品可以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。
【专利说明】
桃潜隐花叶类病毒分子标准样品及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于检测用病毒标准品及其制备方法技术领域，具体涉及桃潜隐花叶类病 毒标准样品及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 桃潜隐花叶类病毒（Peach latent mosaic viroid，PLMVd)属于Avsunviroidae 科，通常含338个左右核苷酸，无中央保守区。其在世界各地的桃栽培区均有发生，主要侵染 桃、梨、李、杏等核果类果树:PLMVd在许多的桃树(Primus persica)品种上为潜伏侵染，潜 隐期可达5~7年，通常没有明显得叶部症状，但带毒桃树生长缓慢，树势衰退，抗性降低。感 病品种染病后，在叶片上形成白色或黄色奶油状的花叶（Peach calico)或印花状病斑，褪 绿斑驳(Peach blotch)，或者是在小叶上形成边缘坏死的花叶症状(Peach mosaic)。病害 发生于桃树生长第二年，症状包括延迟4-6天长叶、开花、成熟;高温时，花瓣出现紫色裂纹； 果实不规则、扁状、色泽暗淡，裂果;芽坏死;桃树易早衰;有些强毒株系使叶片产生花叶、块 斑、杂色和坏死;还有的能导致茎痘斑和卷叶。可经嫁接和桃蚜传染，随无性繁殖材料远距 离传播。据报道，在我国有的果园桃树PLMVd发生较普遍，其造成的经济损失相当严重。目前 尚未有桃潜隐花叶类病毒的恒温扩增方面的检测技术的发明报道。因此，建立简单实用的 桃潜隐花叶类病毒新型检测鉴定方法，对于提高桃潜隐花叶类病毒的检疫检验效率、防止 桃潜隐花叶类病毒的传入、传出，保护我国农业的安全生产，促进我国农产品的顺利出口， 具有十分重要的意义。植物类病毒由于不显性侵染比较普遍，症状表现受环境温度的影响 较大，而且几种鉴别植物对不同类病毒的反应症状相似，故难于应用生物测定的方法。由于 类病毒不能产生任何蛋白质，所以也不能使用检测病毒的电镜、血清学方法。因此，选用分 子生物学方法对桃潜隐花叶类病毒进行检测。
[0003] 系统内送检种苗的样品通常眼观来看都比较健康，而桃潜隐花叶类病毒通常只有 在适宜的条件下才能发病，而且现在用的PCR方法只能从重度感染表现出症状的植物中检 出病毒，无法检测潜在的病毒。随着进出口贸易的增大，检验流程时限要求缩减，植物病毒 疫病多数要进行分子生物学检测，现行的国家和行业标准，都需要标准阳性毒株或阳性对 照质控物进行实验质控，这些阳性毒株的引进需要办理复杂的审批手续，购置费用昂贵，难 度较大，因此普通的植物疫病实验室很难得到该病毒，对实验室的质量控制及研究带来了 极大的挑战。
[0004] 为了帮助实验室建立规范的质量保证，植物病毒及类病毒的标准样品研制工作一 直在开展中。目前，国内外还没有关于该种植物类病毒标准样品的研究。我们将首次开发可 用于快速检测桃潜隐花叶类病毒的分子标准样品及制备技术。本标准样品的研制成功，不 仅为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指 导、服务出口企业提供技术上的支持。该发明成果将有望成为植物疫病分子诊断领域的突 破性产品及技术，是植物流行病学检测技术体系的进一步完善和发展。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种稳定性高、均匀性好的桃潜隐花叶类病毒分子标准样 品及其制备方法。
[0006] 为了得到所述桃潜隐花叶类病毒分子标准样品，根据桃潜隐花叶类病毒(PLMVd) 基因全序列，设计全序列及特异性引物，其碱基序列如下：
[0007] SEQ ID N0：1:TTCGCCGTATGTCAACGGCT
[0008] SEQ ID N0：2:CGCTTAGCGCAGACTCTTCA
[0009] SEQ ID N0：3:GAGTGATGACCTCTCAGCCC
[0010] SEQ ID N0：4:TTCTACGGCGGTACCTGGAT
[0011] 本发明的桃潜隐花叶类病毒分子标准样品，采用如下方法制备：
[0012] (1)采集感染桃潜隐花叶类病毒的植物组织，液氮研磨；
[0013] ⑵步骤⑴得到的植物组织中提取得至I」病毒RNA;
[0014] (3)步骤(2)的病毒RNA作为PCR反应模板，进行RT-PCR扩增反应，其中PCR反应的正 反引物分别为SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2;
[0015] (4)将步骤(3)的PCR扩增产物经纯化后连接至PGEM-T载体中，连接产物转化至感 受态细胞后，LB平板培养，筛选得到阳性克隆；
[0016] (5)阳性克隆中提取得到质粒，即为桃潜隐花叶类病毒的标准样品；
[0017] (6)取制备的核酸标准样品，加入50μ1ΤΕ，溶解后作为模板使用，经采用特异性引 物SEQ ID Ν0:3和SEQ ID Ν0:4进行PCR定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸 样品。
[0018] 上述制备方法中，在步骤(4)中筛选阳性克隆的方法为RT-PCR方法，其中RT-PCR反 应的正反引物分别为SEQ ID Ν0:1和SEQ ID Ν0:2
[0019] 本发明的桃潜隐花叶类病毒分子标准样品稳定性高、均匀性好，为桃潜隐花叶类 病毒的检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指 导、服务出口企业提供技术上的支持。使用本发明的标准样品可以实现不同实验室结果的 比对，从而保证实验室的质量控制。
【附图说明】
[0020] 图1为实施例1中PLMVd目标基因的PCR扩增反应产物的电泳图，其中Μ : DL2000Marker，1~2:PCR扩增产物扩增出292bp大小的片段;3~4:阴性对照。
[0021] 图2是实施例1中PLMVd特异性引物扩增产物电泳结果图，其中1~4:PCR扩增产物 扩增出16 lbp大小的片段;5、6为阴性对照毒株cDNA。
【具体实施方式】
[0022] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。桃潜隐花叶类病毒分子标准样品及其制备方法按如下步骤进行： [0023]实施例1桃潜隐花叶类病毒分子标准样品的制备
[0024] (1)提取病毒 RNA;
[0025]采集O.lg感染桃潜隐花叶类病毒的植物组织加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速 移入1 · 5mL离心管中，加入lmL Trizol Reagent，颠倒混勾，2°C~8°C，12000g，离心10min〇 取上清，15 °C~30 °C，放置5min;加入0.2mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），15s。15 °C~ 30°C，放置2min~3min;2°C~8°C，12000g，离心15min。小心吸取约为600yL的上层水相，勿 扰动中间相和下层相。加500yL异丙醇混合上清液，15°C~30°C，放置lOmin。2°C~8°C， 12000g，离心10min。去除上清液，沉淀中加入lmL 75 %乙醇，洗涤；2 °C~8 °C，7500g，离心 5miη。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30yL~50yL无 RNase的水中，即为待检模板 RNAJ2)目标基因的扩增
[0026]步骤（1)的病毒RNA作为PCR反应模板，本发明自行设计引物，进行RT-PCR扩增反 应，扩增桃潜隐花叶类病毒基因全序列，大小为292bp的片段，其中PCR反应的正反引物序列 如下：
[0027] SEQ ID NO：1：TTCGCCGTATGTCAACGGCT
[0028] SEQ ID NO：2:CGCTTAGCGCAGACTCTTCA
[0029] 扩增溶液中加入2 X RT-PCR buffer(10倍聚合酶链式Mix反应液）12 · 5yL, lOpmol/ yL SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2各0.5yL，将提取的待测样品RNA加入反应体系中，DEPC水补 足体积至25yL，PCR循环条件为：48 ￡€3〇11^11，94°(：预变性51^11后，进入94°(：变性3〇8,53°(：退 火40s，72°C延伸45s，共循环35次;然后72°C再延伸lOmin.
[0030] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶 化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5yg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面 刚刚没过凝胶;将3yL~6yL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样;9V/cm恒压电 泳，直至溴酚蓝指示剂迀移至凝胶中部;紫外检测仪下观察电泳结果，待检田间样品能够扩 增出预期条带，扩增条带为292bp，电泳结果见图1和图2。
[0031] (3)目标基因的序列测定
[0032]将PCR扩增产物送宝生物（大连)有限公司进行测序，测序结果如SEQ ID N0.5。将 所得序列通过NCBI在线nucleotide blast分析，结果表明：该核苷酸序列与桃潜隐花叶类 病毒(PLMVd)的核酸序列相似性最高达99%，为桃潜隐花叶类病毒基因全序列。
[0033] (4)目标基因的纯化
[0034] 将步骤（2)中PCR扩增产物采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0试剂盒(货号DV805A)，并按其操作说明回收目标分子DNA片段，即SEQ ID NO. 5所示 的PLMVd N基因全序列。
[0035] (5)目的片段的连接转化
[0036] 在步骤（4)中纯化得到的目的片段4yL，2XRapid ligation buffer 5yL，PGEM-T 载体0.5yL，T4DNA Ligase 0.5yL，用无菌水补充至10yL，室温连接lh。将连接产物加入到制 备好的感受态细胞E. col i JM109中，轻轻用移液器混匀，冰浴20min，42°C热应激lmin，冰浴 2min，加入800yL S0C培养基，150g摇菌1 · 5h，1000g离心10min，弃去培养液，加入新鲜的S0C 培养基200yL，混匀后涂在含有Amp+的LB平板上，风干后，37°C倒置培养12h-16h。
[0037] 挑取单克隆菌在LB培养液中进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选，PCR体系 及反应条件见步骤(2)。将扩增产物进行琼脂糖电泳鉴定，结果获得了与预期大小一致的 292bp片段。
[0038] 应用Omega公司质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I(lOOtest)，提取纯化上述步 骤中筛选得到的阳性克隆，获得重组质粒PGEM-T-PLMVd，每支EP管分装成1 OOyL，每支重组 质粒含量为lyg，即为桃潜隐花叶类病毒分子标准样品。
[0039] (6)标准品的鉴定
[0040]取制备的核酸标准样品，加入50μ1ΤΕ，溶解后作为模板使用，经采用特异性引物 SEQ ID Ν0:3和SEQ ID Ν0:4进行PCR定性分析，扩增产物161bp，确认所制备的核酸标准样 品为目的核酸样品。
[0041] SEQ ID N0：3：GAGTGATGACCTCTCAGCCC
[0042] SEQ ID NO：4:TTCTACGGCGGTACCTGGAT
[0043] 扩增溶液中加入2\?〇?131^€61(10倍聚合酶链式組1反应液）12.541^1(^111〇1/^1^ SEQIDN0:3和SEQIDN0:4各0.5μL，将PLMVD标准品DNA加入反应体系中，DEPC水补足体积 至25yL，PCR循环条件为：94°C预变性5min后，进入94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸 30s，共循环35次;然后72°C再延伸10min.。
[0044] 实施例2桃潜隐花叶类病毒分子标准样品的均匀性实验
[0045]桃潜隐花叶类病毒分子标准样品的均匀性测定是将如实施例1的方法制备的 PLMVd分子标准样品随机分成两个样品组，即样品组A和样品组B，每个样品组各有15个标准 样品，每个样品按照如下反应条件进行PCR扩增，测定PCR产物浓度(ng/VL)，通过比较PCR产 物的浓度变化，按照统计学方法评价标准样品的均匀性，
[0046] PCR反应体系：反应管中加入桃潜隐花叶类病毒分子标准样品lyL(含lXl(r2yg DNA)，2XPCR buffer(10倍聚合酶链式Mix反应液）12.5yL，10pmolAiL SEQ ID N0:3和SEQ ID NO: 4各0.5yL，DEPC水补足体积至25yL。
[0047] PCR反应条件:94°C预变性5min后，进入94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s， 共循环35次;然后72°C再延伸10min。
[0048] 结果如表1，2和3。
[0049] 表1桃潜隐花叶类病毒分子标准样品均匀性测定结果
[0052] 表2桃潜隐花叶类病毒分子标准样品均匀性评价结果
[0053]
[0054] 表3桃潜隐花叶类病毒分子标准样品均匀性检测
[0057] 从表1及其统计结果(表2和表3)的结果可知，两个样品组之间不存在显著差异，可 以认为样品是均匀的。
[0058] 实施例3桃潜隐花叶类病毒分子标准样品的稳定性实验
[0059] 将实施例1的方法制备的桃潜隐花叶类病毒分子标准样品随机分组，每个样品按 照实施例2所述的PCR反应体系和PCR反应条件下进行PCR扩增，测定PCR产物浓度(ng/yL)， 通过比较PCR产物的浓度变化，按照统计学方法评价标准样品的稳定性。
[0060] 采用两种类型的稳定性试验：
[0061] -种是在-20°C下的稳定性试验，随机取桃潜隐花叶类病毒分子标准样品24份，每 个月检测2份，连续12个月，结果如表4。
[0062] 另一种是在较高的温度20°C下的稳定性试验，随机取桃潜隐花叶类病毒分子标准 样品12份，每周检测3份，连续4周，测试结果如表5。
[0063] 表4.稳定性检验实验(-20 °C)
[0064]
[0065] 对表4结果的F检验结果为F = 3.4615，F勃.Q5 = 4.2838，F<FCr[Q.()5,5,5]，即样品间无 显著性差异。
[0066] 表5.稳定性检验实验(20°C)结果
[0067]
[0068] 表6.方差分析
[0071] 对表6结果方差分析结果为F = 5.7777，F勃.Q5 = 4.066，F<FCr[Q.()5,5,5]，即样品间无 显著性差异。
[0072]实施例4定值方法
[0073]由实施例1的方法制备的桃潜隐花叶类病毒分子标准样品随机选15个，每个样品 按照实施例2所述，用桃潜隐花叶类病毒聚合酶链反应方法进行定值试验，结果完全一致， 均为桃潜隐花叶类病毒核酸阳性。
[0074]本桃潜隐花叶类病毒分子标准样品经福建检验检疫局、烟台检验检疫局、甘肃检 验检疫局、广东检验检疫局等协作试验定值结果统计见表7。
[0075]表7.协作试验定值结果表
[0076]
[0077] 应用桃潜隐花叶类病毒聚合酶链反应方法对本标准样品的定值实验结果均为桃 潜隐花叶类病毒核酸阳性。
【主权项】
1. 一种桃潜隐花叶类病毒标准样品的制备方法，其特征在于，制备步骤如下： (1) 采集感染桃潜隐花叶类病毒的植物组织，液氮研磨； (2) 步骤(1)得到的植物组织中提取得到病毒RNA; (3) 步骤(2)的病毒RNA作为PCR反应模板，进行RT-PCR扩增反应，其中PCR反应的正反引 物分别为SEQ ID NO: 1 和SEQ ID NO:2; (4) 将步骤(3)的PCR扩增产物经纯化后连接至PGEM-T载体中，连接产物转化至感受态 细胞后，LB平板培养，筛选得到阳性克隆； (5) 阳性克隆中提取得到质粒，即为桃潜隐花叶类病毒的标准样品； 其中所述感受态细胞为E.coli JM109。2. -种利用权利要求1所述方法制备的桃潜隐花叶类病毒标准样品。
【文档编号】C12Q1/70GK105950616SQ201610355529
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】吴兴海, 张成标, 王振华, 李明哲, 邵秀玲, 张京宣, 王英超
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心