一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法。
【背景技术】
[0002]甘草为豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat或光果甘草Glycyrrhiza glabra L的干燥根及根莖。是我国传统中药材，素有〃国老〃之称，味甘、性平。归心、肺、脾、胃。补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒。可缓解药物毒性、烈性。甘草广泛应用于医药、烟草、食品等领域。其富含三萜和黄酮类成分，其中五环三萜类化合物甘草酸是主要有效成分之一。甘草酸经胃酸水解或经肝中葡萄糖醛酸酶分解形成甘草次酸在体内发挥药理作用。甘草次酸(Glycyrrhetinic Acid)的分子式为C3qH46O4,分子量470.64KD，为白色结晶性粉末，熔点为288-297°C。近年随着现代中药的发展，各国学者在中医理论的基础上，对甘草有效成分-甘草次酸的药理作用进行了深入研究。研究发现甘草次酸不仅具有抗炎、抗溃疡、抗病毒、降血脂、镇咳、平喘及祛痰等作用，还可用于防治病毒性肝炎、高血脂症和癌症等疾病，是有效的干扰素诱生剂及细胞免疫调节剂。医药生产企业常采用水提、含水醇提、碱提等方法从甘草药材中提取甘草酸，提取后所剩余的甘草药渣通常作为工业废料弃去。进一步的研究表明甘草药渣中富含大量的甘草次酸化合物。因而，甘草药渣是一种宝贵的可再利用资源。专利CN 103142682B公开了“一种从甘草渣中提取甘草黄酮的方法”专利CN102363796B公开了 “一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法”但是从甘草药渣中提取甘草次酸的报道还尚未多见。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法。该方法显著提高了甘草次酸的含量。
[0004]一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，包括如下步骤:
[0005]1、菌种的活化:将黄曲霉Aspergillus flavusHC-12接种于改良PDA培养基，然后按0.5%接种量接种于液体培养基中进行培养，培养时间2?4d，温度为20?30°C ；
[0006]2、发酵培养:将处于生长期的经液体培养基培养的菌种按10%接种量接种于含新鲜甘草渣发酵液的密闭发酵瓶中进行发酵培养，即得甘草次酸发酵液；
[0007]3、分离:将甘草渣发酵液中甘草次酸进行分离，即得甘草次酸粗品。
[0008]优选的是，所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，步骤I中改良PDA培养基组成为:土豆汁100g、葡萄糖100g、琼脂50g、蛋白胨100g、蒸馈水1000ml、pH7.0
[0009]优选的是，所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，步骤2中的液体培养基各原料质量份数为:玉米汁0.5?1.5份，葡萄糖2.5?5.0份，甜高粱秸杆粉1.5?5.0份、酒石酸铵0.2?1.5份，、硫酸铵0.1?1.0份，硫酸镁0.05?0.1份，磷酸二氢钾0.08?0.15份，其余为蒸馏水。
[0010]优选的是，所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，步骤2中的液体培养基培养条件为:菌株置于无菌三角瓶中于转速lOOrpm的摇床中振摇培养，培养18_24h.
[0011]优选的是，所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，步骤2中的新鲜甘草渣发酵液各原料质量份数组成为:甘草渣10?30份、酒石酸铵0.2?0.5份，磷酸氢二钾0.2?0.5份，硫酸镁0.05?0.1份，氯化钙0.01?0.05份，吐温800.01?0.05份、磷酸铵0.1?0.5份，其余为蒸馏水，初始pH4?5。
[0012]优选的是，所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，步骤2中新鲜甘草渣发酵液中甘草渣制备方法为:甘草经加工提取甘草酸后的残渣，风干粉碎至粒径为0.25m，含水率为10%。
[0013]优选的是，所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，步骤2中发酵条件为:新鲜甘草渣发酵液40?100ml、发酵温度30?40 °C，搅拌速度为150?180rpm，发酵4?6d0
[0014]优选的是，所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，分离过程包括以下步骤:
[0015]a、将甘草次酸发酵液于转速2000-2500r/min条件下离心lOmin，过滤，上清液备用；
[0016]b、将发酵滤渣按固液比为1:10进行蒸馏水连续回流提取1-4次，离心、过滤，取上清液；
[0017]c、将步骤a与步骤b中的上清液合并减压浓缩至料水比为1:5-10，然后按照乙酸乙酯:浓缩液1:2体积比，萃取3-5次，pH4?6，温度为30?60°C。后减压蒸馏除去溶剂，即得甘草次酸粗品。
[0018]本发明提供的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法具有以下突出特点
[0019]1、利用微生物在生长过程中产生大量的酶，通过微生物的酶促反应，将甘草药渣细胞壁上的木质素、纤维素等大分子分解掉，促使甘草次酸等活性物质溶出，与一般的物理或化学加工方法相比大幅度提高甘草次酸的溶出量，且减少了废液排放和环境污染，大大降低了甘草次酸的工业生产成本。
[0020]2、本发明通过发酵培养和目标产品的分离工艺，得到甘草次酸发酵量范围为5.22-6.78g/L，甘草次酸含量范围 6.702-6.898mg/g。
【附图说明】
[0021 ] 图1甘草次酸标准品的HPLC图谱
[0022]图2甘草次酸粗品的HPLC图谱
【具体实施方式】
[0023]下面通过实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0024]实施例1
[0025]1、菌种的活化:将黄曲霉Aspergillus flavusHC-12接种于含有改良PDA培养基的锥形瓶中，按0.5%接种量接种于液体培养基中进行培养，温度为20°C ;培养时间2d ;液体培养基的质量份数组成为:玉米汁0.5份，葡萄糖2.5份，甜高粱秸杆粉1.5份、酒石酸铵0.2份，、硫酸铵0.1份，硫酸镁0.1份，磷酸二氢钾0.15份，其余为蒸馏水；
[0026]2、发酵培养:将处于生长期的经液体培养基培养的菌种按10%接种量接种于40ml含新鲜甘草渣发酵液的密闭发酵瓶中进行发酵培养，发酵温度30°C，搅拌速度为150rpm，发酵4d即得甘草次酸发酵液；新鲜甘草渣发酵液质量份数组成为:甘草渣10份、酒石酸铵0.2份，磷酸氢二钾0.2份，硫酸镁0.05份，氯化钙0.01份，吐温800.01份、磷酸铵0.1份，其余为蒸馏水，初始pH4.0
[0027]3、一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，分离过程包括以下步骤:
[0028]a、将甘草次酸发酵液于转速2000r/min条件下离心lOmin，过滤，上清液备用；
[0029]b、将发酵滤渣按固液比为1:10进行蒸馏水连续回流提取4次，离心、过滤，取上清液；
[0030]C、将步骤a与步骤b中的上清液合并减压浓缩至甘草次酸:水比为1:10，然后按照乙酸乙酯:浓缩液1:2体积比，萃取3次，pH4.0，温度为30°C。后减压蒸馏除去溶剂，即得甘草次酸粗品。经检测甘草次酸发酵量为5.64g/L
[0031]考察甘草次酸的产量，采用高效液相法检测甘草次酸
[0032]1、标准曲线的制备
[0033]1.1标准溶液的制备
[0034]精密称取甘草次酸对照品10mg，用甲醇适量超声溶解，加甲醇至刻度，摇匀，配成甘草次酸对照品溶液。再精密吸取1.5,2.5,3.5,4.5,5.5mL,置量瓶中，配成各个浓度的甘草次酸标准品溶液。
[0035]1.2标准曲线的绘制
[0036]分别取各个浓度的甘草次酸对照品溶液1yL,依次进样，测定峰面积，记录色谱图及色谱峰面积，以进样量(yg)对峰面积进行线