性回归，得标准曲线方程为Y =669734X+4430.05，相关系数 r = 0.9997，线性范围为 0.401-1.989 μ g
[0037]2、样品的含量测定
[0038]2.1样品的制备
[0039]精密称取本发明实施例1制得的甘草次酸粗品10mg，置于50mL量瓶中，用适量甲醇溶解，超声处理15min,冷却，加甲醇至刻度，充分摇勾，于10000r/min离心15min,取上清液备用；
[0040]2.2含量测定
[0041]分别吸取样品的上清液1yL进样，记录吸收峰面积，同时进样甘草次酸标准品溶液，用外标一点法计算样品中甘草次酸的含量。在选定的色谱条件下，测得供试品中甘草次酸色谱峰不受其他成分干扰，结果如图1所示。
[0042]3、结果
[0043]经测定甘草次酸粗品中甘草次酸的含量为6.891mg/g
[0044]实施例2
[0045]1、菌种的活化:将黄曲霉Aspergillus flavusHC-12接种于含有改良PDA培养基的锥形瓶中，按0.5%接种量接种于液体培养基中进行培养，温度为20°C ;培养时间2d ;液体培养基的质量份数组成为:玉米汁1.5份，葡萄糖2.0份，甜高粱秸杆粉1.0份、酒石酸铵0.3份，、硫酸铵0.3份，硫酸镁0.5份，磷酸二氢钾0.1份，其余为蒸馏水；
[0046]2、发酵培养:将处于生长期的经液体培养基培养的菌种按10%接种量接种于60ml含新鲜甘草渣发酵液的密闭发酵瓶中进行发酵培养，发酵温度30°C，搅拌速度为160rpm，发酵4d即得甘草次酸发酵液；新鲜甘草渣发酵液质量份数组成为:甘草渣15份、酒石酸铵0.3份，磷酸氢二钾0.3份，硫酸镁0.02份，氯化钙0.02份，吐温800.03份、磷酸铵0.5份，其余为蒸馏水，初始pH5.0
[0047]3、一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，分离过程包括以下步骤:
[0048]a、将甘草次酸发酵液于转2500r/min条件下离心lOmin，过滤，上清液备用；
[0049]b、将发酵滤渣按固液比为1:10进行蒸馏水连续回流提取3次，离心、过滤，取上清液；
[0050]c、将步骤a与步骤b中的上清液合并减压浓缩至甘草次酸:水比为1:8，然后按照乙酸乙酯:浓缩液1:2体积比，萃取4次，pH6.0，温度为35°C。后减压蒸馏除去溶剂，即得甘草次酸粗品。经检测甘草次酸发酵量为5.37g/L
[0051]甘草次酸检测方法与实施例1相同
[0052]经测定甘草次酸粗品中甘草次酸的含量为6.753mg/g
[0053]实施例3
[0054]1、菌种的活化:将黄曲霉Aspergillus flavusHC-12接种于含有改良PDA培养基的锥形瓶中，按0.5%接种量接种于液体培养基中进行培养，温度为20°C ;培养时间2d ;液体培养基的质量份数组成为:玉米汁1.0份，葡萄糖1.8份，甜高粱秸杆粉1.5份、酒石酸铵0.5份，、硫酸铵0.5份，硫酸镁0.3份，磷酸二氢钾0.3份，其余为蒸馏水；
[0055]2、发酵培养:将处于生长期的经液体培养基培养的菌种按10%接种量接种于60ml含新鲜甘草渣发酵液的密闭发酵瓶中进行发酵培养，发酵温度30°C，搅拌速度为160rpm，发酵4d即得甘草次酸发酵液；新鲜甘草渣发酵液质量份数组成为:甘草渣12份、酒石酸铵0.5份，磷酸氢二钾0.2份，硫酸镁0.05份，氯化钙0.05份，吐温800.04份、磷酸铵0.4份，其余为蒸馏水，初始pH6.0
[0056]3、一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，分离过程包括以下步骤:
[0057]a、将甘草次酸发酵液于转2500r/min条件下离心lOmin,过滤，上清液备用；
[0058]b、将发酵滤渣按固液比为1:10进行蒸馏水连续回流提取4次，离心、过滤，取上清液；
[0059]c、将步骤a与步骤b中的上清液合并减压浓缩至甘草次酸:水比为1:5，然后按照乙酸乙酯:浓缩液1:2体积比，萃取4次，pH4.0，温度为40°C。后减压蒸馏除去溶剂，即得甘草次酸粗品。经检测甘草次酸发酵量为6.23g/L
[0060]甘草次酸检测方法与实施例1相同
[0061 ] 经测定甘草次酸粗品中甘草次酸的含量为6.764mg/g
【主权项】
1.一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)、菌种的活化:将黄曲霉AspergillusflavusHC-12接种于改良PDA培养基，然后按0.5%接种量接种于液体培养基中进行培养，培养时间2?4d，温度为20?30°C ； 2)、发酵培养:将处于生长期的经液体培养基培养的菌种按10%接种量接种于含新鲜甘草渣发酵液的密闭发酵瓶中进行发酵培养，即得甘草次酸发酵液； 3)、分离:将甘草渣发酵液中甘草次酸进行分离，即得甘草次酸粗品。2.根据权利要求1所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，其特征在于:步骤1中改良PDA培养基组成为:土豆汁100g、葡萄糖100g、琼脂50g、蛋白胨100g、蒸馏水1000ml、ρΗ7.0。3.根据权利要求1所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，其特征在于:步骤2)中的液体培养基各原料质量份数为:玉米汁0.5?1.5份，葡萄糖2.5?5.0份，甜高粱秸杆粉1.5?5.0份、酒石酸铵0.2?1.5份，、硫酸铵0.1?1.0份，硫酸镁0.05?0.1份，磷酸二氢钾0.08?0.15份，其余为蒸馏水。4.根据权利要求1所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，其特征在于:步骤2中的液体培养基培养条件为:菌株置于无菌三角瓶中于转速lOOrpm的摇床中振摇培养，培养 18-24ho5.根据权利要求1所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，其特征在于:步骤2中的新鲜甘草渣发酵液各原料质量份数为:甘草渣10?30份、酒石酸铵0.2?0.5份，磷酸氢二钾0.2?0.5份，硫酸镁0.05?0.1份，氯化钙0.01?0.05份，吐温800.01?0.05份、磷酸铵0.1?0.5份，其余为蒸馏水，初始pH4?5。6.根据权利要求5所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，其特征在于:甘草渣制备方法为:甘草经加工提取甘草酸后的残渣，风干粉碎至粒径为0.25m，含水率为10%。7.根据权利要求1所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，其特征在于:步骤2中发酵条件为:新鲜甘草渣发酵液40?100ml、发酵温度30?40°C，搅拌速度为150?180rpm，发酵 4 ?6d。8.根据权利要求1所述的一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，其特征在于:甘草次酸发酵液分离包括以下步骤: a、将甘草次酸发酵液于转速2000-2500r/min条件下离心lOmin,过滤，上清液备用； b、将发酵滤渣按固液比为1:10进行蒸馏水连续回流提取1-4次，离心、过滤，取上清液； c、将步骤a与步骤b中的上清液合并减压浓缩至料水比为1:5，然后按照乙酸乙酯:浓缩液1:2体积比，萃取3-5次，pH4?6，温度为30?60°C。后减压蒸馏除去溶剂，即得甘草次酸粗品。
【专利摘要】本发明公开了一种利用甘草药渣生产甘草次酸的方法，涉及微生物技术领域。本发明经菌种活化、发酵培养、甘草次酸发酵液分离制得甘草次酸粗品。利用微生物在生长过程中产生大量的酶，通过微生物的酶促反应，将甘草药渣细胞壁上的木质素、纤维素等大分子分解掉，促使甘草次酸等活性物质溶出，与一般的物理或化学加工方法相比大幅度提高甘草次酸的溶出量,且减少了废液排放和环境污染。通过本发明发酵培养和目标产品的分离工艺，得到甘草次酸发酵量范围5.22-6.78g/L，甘草次酸含量范围6.702-6.898mg/g，大大提高了原料利用率，降低了工业生产成本。
【IPC分类】C12R1/67, C12P33/00
【公开号】CN105238839
【申请号】CN201510659417
【发明人】马小海
【申请人】马小海
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年10月13日