青霉素结合蛋白抗菌剂的制备及其新用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及青霉素结合蛋白提取物及其新用途，特别是涉及一种青霉素结合蛋白 提取物在抑制果树或蔬菜真菌中的新用途。
【背景技术】
[0002] 作物病害控制是农业生产中重要的环节，其病原种类多，危害寄主广，发生面积 大，适应性强，给农业生产造成的损失严重而又难于控制。之前主要依靠使用大量化学农药 来防治植物病害，但是其对环境和人类健康造成了非常大的负面影响。近年来，由于微生物 农药其具有抗菌谱广、活性功能多样化等优点，更加引起对生物农药的关注。抗菌蛋白具有 相对分子量小、杀菌范围广、作用机制独特等特点，并且具有广谱抗菌的优点，是理想的化 学农药替代品。但现有文献和现实生产中青霉素结合蛋白在制备微生物源抑菌剂中的应用 鲜见报道，本发明的创新之处在于发现了青霉素结合蛋白作为一种新型抑菌蛋白在桃褐腐 病病害上的应用。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种青霉素结合蛋白提取物。
[0004] 本发明的另一目的在提供一种青霉素结合蛋白提取物的新用途。
[0005] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0006] 本发明所述的青霉素结合蛋白提取物加入常规辅料，按照常规工艺，制成各种制 剂，如喷雾剂、乳油、悬浮剂或粉剂。
[0007] 本发明提供了一种与环境兼容性好、对哺乳动物安全的新型微生物源抑菌剂，对 生态良好发展、人类的健康和园艺病害的综合治理都具有深远的意义。与传统的农药相比， 本发明具有以下的特点和优点：1、可以在细菌中可以超量表达，成本低，可以成为很好的开 发资源；2、该蛋白不造成农药药害、毒性残留，对人畜、生态环境安全；3、该蛋白基因克隆 后，十分有利于进行工业化生产。
[0008] 下述实验例和实施例用于进一步说明本发明但不限于本发明。
[0009] 实验例1 :
[0010] 本发明青霉素结合蛋白提取物，由如下方法制成：取胰蛋白胨10重量份，酵母提 取物（如上海津南贸易有限公司或山东烟台华海生物制品有限公司生产）5重量份，氯化钠 10重量份，蒸馏水1000体积份，常温搅拌；用移液枪按照1 %的接种量将菌种金色葡萄球菌 接种入液体培养基中，放入36摄氏度摇床，转速180转/分钟，振荡培养24小时；将振荡培 养后的菌体悬液转入灭菌离心管，置入转速为8000转/分钟的冷冻离心机离心10分钟，取 上清液；然后对上清液中粗蛋白进行盐析，再将其用经阴离子柱层析纯化，通过液相色谱与 标品对照，获得该纯化物。再于旋转蒸发仪中浓缩到体积比1 : 100,再将浓缩液放于冷冻 干燥机中冷干，即得青霉素结合蛋白提取物。
[0011] 实验例2 :
[0012] 本发明抑菌蛋白洗脱峰组分抑菌活性测定，是由如下方法制成：采用平板涂布打 孔法测定，以下工作在超净台中进行。取各个组分经过0.22μm滤菌器滤菌。取各个组分 200uL蛋白液分别均匀涂在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上。以20mmol/L磷酸缓冲液涂在 马铃薯葡萄糖琼脂培养基作为空白对照（CK)。用打孔器将长满桃褐腐的马铃薯葡萄糖琼脂 培养基打孔。用接菌针将打下来长的琼脂块挑下来，有孢子一面向下贴在马铃薯葡萄糖琼 脂培养基中央。每组平行三次。28°C培养，观察抑菌效果并记录数据，即对抑菌蛋白洗脱峰 组分进行抑菌活性测定。实验结果见下表1 :
[0013] 表1青霉素结合蛋白不同流分抑菌效果的影响
[0014]
[0015] 实验例3 :
[0016] 本发明抑菌蛋白粗提物浓度不同梯度抑菌活性测定，是由如下方法制成：获得最 佳硫酸铵饱和度后，将最适浓度下的蛋白提取液滤菌后在超净台中按照梯度稀释4个梯 度，取4根已灭菌的试管，第一根试管中加入5ml粗蛋白原液，再将另外三根试管中各加 4.5ml20mmol/L的磷酸盐缓冲液。取0.5ml原液于第二根试管中，混合均匀，即为10倍稀 释；然后取〇.5ml10倍稀释物于第三根试管中，混合均匀，即为100倍稀释；取0.5ml100 倍稀释物于第四根试管中，混合均匀，即为1000倍稀释物。将每个梯度的蛋白液各取200uL 均匀涂在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上。以20mmol磷酸缓冲液涂在马铃薯葡萄糖琼脂 培养基作为空白对照（CK)。用打孔器将长满桃褐腐的马铃薯葡萄糖琼脂培养基打孔。用接 菌针将打下来长的琼脂块挑下来，有孢子一面向下贴在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中央，每 组平行三次。28°C培养，在4天观察抑菌效果并记录数据，即对抑菌蛋白粗提物不同浓度梯 度进行抑菌活性测定。实验结果见下表2:
[0017] 表2不同浓度青霉素结合蛋白对桃褐腐病菌的影响
[0018]
[0019] 表3.青霉素结合蛋白对桃褐腐病的生物活性（4d，平板法）
[0020]
[0021] 结果证明，本发明所述青霉素结合蛋白对桃褐腐病真菌有显著的抑制活性。
[0022] 下述实施例均能实现上述实验例的效果。
[0023] 实施例1
[0024] 将青霉素结合蛋白加入溶剂、乳化剂、稳定剂等常规辅料，按照常规工艺制成乳 油。
[0025] 实施例2
[0026] 将青霉素结合蛋白加入填料（如滑石粉）和少量助剂经混合、粉碎再混合至一定 细度制成粉剂。
【主权项】
1. 一种青霉素结合蛋白提取物，其特征在于：它是由金色葡萄球菌Staphylococcus aureus Rosenbach 菌株产生的。2. -种青霉素结合蛋白的分离纯化，其特征在于：其由如下方法制成： 取胰蛋白胨10重量份，酵母提取物（如上海津南贸易有限公司或山东烟台华海生物制 品有限公司生产）5重量份，氯化钠10重量份，蒸馏水1000体积份，常温搅拌；用移液枪按 照1 %的接种量将菌种金色葡萄球菌接种入液体培养基中，放入36摄氏度摇床，转速180转 /分钟，振荡培养24小时；将振荡培养后的菌体悬液转入灭菌离心管，置入转速为8000转 /分钟的冷冻离心机离心10分钟，取上清液；然后对上清液中粗蛋白进行盐析，再将其用阴 离子柱层析纯化，通过液相色谱与标品对照，获得该蛋白的纯化物。将其于旋转蒸发仪中浓 缩到体积比1 : 100,再将浓缩液放于冷冻干燥机中冷干，即得青霉素结合蛋白提取物。3. -种青霉素结合蛋白提取物，其特征在于：抑制的病原真菌为褐腐菌。4. 如权利要求1所述的青霉素结合蛋白在抑制果树或蔬菜真菌中的应用。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述抑制果树或蔬菜真菌是指抑制褐腐病。
【专利摘要】本发明公开一种青霉素结合蛋白提取物及其新用途。该蛋白在抗菌方面的功能尚未报告，本发明青霉素结合蛋白提取物通过DEAE-Cellulose阴离子交换层析获取高纯度青霉素结合蛋白，采用平板涂布打孔法测定针对不同浓度青霉素结合蛋白对褐腐病菌的影响。经抗菌谱测定，该蛋白具有广谱抗菌性，抗菌活性强等优点，同时对哺乳动物安全，不造成农药药害、毒性残留，对人畜、生态环境安全，同时十分有利于进行工业化生产，从而为农业病虫害的生物防治提供科学依据。
【IPC分类】A01N63/02, C12R1/445, C07K1/36, C07K1/18, C12P21/00, A01P3/00, C07K1/30
【公开号】CN105238830
【申请号】CN201510740837
【发明人】任建军, 李永平, 李秋水, 张长现, 梁硕, 何文豪
【申请人】北京光禾生物科技有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月5日