紫红曲霉及其在制备1-脱氧野尻霉素中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株新菌株，特别涉及一株能够生产1-脱氧野尻霉素的红曲霉及应 用，利用能够产生卜脱氧野尻霉素的紫红曲霉（Monascuspurpureus)以大米等粮食原料 进行发酵。 (二）
【背景技术】
[0002] 红曲是红曲霉在大米等粮食上的发酵产物，在中国有千余年的应用历史。红曲的 应用范围包括食品的酿造、着色和保藏，以及中药等领域。按照国家相关标准（GB2760，GB 4926)，红曲可作为食品添加剂；按照卫生部发布的《真菌类保健食品评审规定》（卫法监发 〔2001〕84号），红曲霉（Monacusanka)和紫红曲霉（Monascuspurpureus)属于可用于保 健食品的真菌菌种；《中华人民共和国药典》也将红曲收录为中药材。目前，利用红曲霉能 够产生胆固醇生物合成抑制剂一莫拉可林（monacolin)，已成功开发出以红曲为主要成分 的降脂中药和保健品。进一步研发具有其它功效的新型红曲产品，对红曲产业的发展有积 极的促进作用。
[0003] 糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病，据《美国医学会杂志》（TheJournalof theAmericanMedicalAssociation)报道：2013年全世界大约有3. 82亿糖尿病患者，糖 尿病已成为全球第四大导致死亡的疾病，开发廉价、有效的预防或改善糖尿病的功能性食 品具有重要意义。a-葡萄糖苷酶抑制剂能竞争性抑制小肠内的各种a-葡萄糖苷酶，减 缓淀粉分解为葡萄糖的速度，从而减慢肠道对葡萄糖的吸收，降低餐后的高血糖。天然的 a-葡萄糖苷酶抑制剂存在于动物、植物和微生物中，从微生物中筛选a-葡萄糖苷酶抑制 剂来源菌，具有广阔的工业化应用前景。目前，已发现某些放线菌和芽孢杆菌产生的1-脱 氧野尻霉素具有较好的a-葡萄糖苷酶抑制作用。
[0004] 按照常规方法制备的红曲，由于红曲霉产生和分泌多种胞外水解酶（包括多种淀 粉酶），所以常用作酿造糖化剂（酒曲），促进发酵原料中淀粉的分解；或者作为中药材，与 其它药材配伍，促进食物的消化和吸收，如《本草纲目》所记载的"红曲主治消食活血，健脾 燥胃"。这说明常规红曲具有促进淀粉等碳水化合物分解的催化活性，一般不具有a-葡萄 糖苷酶抑制活性。虽然有研究指出，红曲在降低血脂的同时，对血糖有一定的改善作用，但 是其有效成分尚不清楚，作用机制也不明确。同时，目前没有红曲霉能够产生1-脱氧野尻 霉素，以及在红曲产品中发现含有1-脱氧野尻霉素的报道。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一株新菌株一紫红曲霉（Monascuspurpureus)浙工1号及其 制备1-脱氧野尻霉素的应用。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明涉及一株新菌株一紫红曲霉（Monascuspurpureus)浙工红曲1号，保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年7月18日，地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo. 9553。
[0008] 本发明还涉及一种所述紫红曲霉浙工红曲1号在制备1-脱氧野尻霉素中的应用， 具体所述的应用以紫红曲霉浙工红曲1号经液体培养基或固体培养基培养获得的培养物 作为菌种，接种至发酵培养基，在温度25?40°C、湿度60%?90%的条件下进行固态发酵， 发酵完成后，获得含1-脱氧野尻霉素的发酵产物（即为含1-脱氧野尻霉素的红曲），将 发酵产物分离纯化，获得1-脱氧野尻霉素；所述发酵培养基由食用粮食、葡萄糖、蛋白胨和 自来水组成，所述食用粮食与葡萄糖、蛋白胨和自来水的质量比为1:0.01?〇. 1:0. 015? 0? 15:0. 2 ?0? 8 (优选 1:0. 03:0. 01:0. 3);
[0009] 所述液体培养基质量终浓度组成为：70?120目大米粉或可溶性淀粉1%?4%， 葡萄糖或蔗糖〇.5%?3%，蛋白胨0.3%?3%，似勵30.1%?0.5%，腿 2卩04 0.1 %? 0.5%，溶剂为自来水，pH值自然；优选液体培养基质量终浓度组成为：100目大米粉2%，葡 萄糖2%，蛋白胨0. 8%，NaN03 0. 2%，KH2P04 0. 15%，溶剂为自来水，pH值自然。
[0010] 所述固体培养基由大米、葡萄糖、蛋白胨和自来水构成，所述大米与葡萄糖、蛋白 胨和自来水的质量比为1:0. 01:0. 005:0. 3。
[0011] 进一步，所述食用粮食为籼米、粳米、糯米、红米、黑米、小米、黄豆、大麦或玉米。
[0012] 进一步，所述固体菌种与食用粮食质量比为0? 005?0? 05:1 (优选0? 01:1)，所述 液体菌种体积用量以食用粮食质量计为0. 1?0. 3mL/g(优选0.lmL/g)。
[0013] 进一步，所述紫红曲霉浙工红曲1号以106?107cfu/mL孢子悬液的形式接种至液 体培养基或固体培养基培养获得的培养物作为菌种，所述孢子悬液是将紫红曲霉浙工红曲 1号接种在EMA培养基上，32°C培养7天，用无菌水洗下孢子，将孢子用无菌水调整浓度为 106?107cfu/mL;每升麦芽提取粉琼脂培养基（MEA):麦芽提取粉20g，蛋白胨1. 0g，葡萄糖 20g，琼脂15g，加蒸馈水至1L。
[0014]进一步，所述菌种的制备方法为下列之一：（1)将106?10 7cfu/mL紫红曲霉浙工 红曲1号孢子悬液以体积浓度10% (v/v)的接种量接种至液体培养基，在32°C培养2天，取 培养物作为液体菌种；所述液体培养基质量终浓度组成为：1〇〇目大米粉2%，葡萄糖2%， 蛋白胨0.8%，似勵 30.2%，腿2?04 0.15%，溶剂为自来水411值自然；（2)将106?10\包/ mL紫红曲霉浙工红曲1号孢子悬液接种至固体培养基，在温度为30°C，湿度为80%的条 件下培养10天，将培养物作为固体菌种；所述孢子悬液体积用量以固体培养基质量计为 0.lmL/g;所述固体培养基组由大米、葡萄糖、蛋白胨和自来水组成，所述大米与葡萄糖、蛋 白胨和自来水质量比为1:0. 01:0. 005:0. 3。
[0015] 进一步，所述发酵产物分离纯化方法为：将含1-脱氧野尻霉素的发酵产物在55°C 真空烘干，磨成80目粉，分别以5倍（v/w)的体积浓度70%乙醇水溶液在25°C浸提3次， 每次提取24h，提取液合并、过滤，滤液真空浓缩至膏状，获得浓缩物a;将浓缩物a进行硅胶 柱层析，依次用乙酸乙酯、无水乙醇、蒸馏水进行洗脱，收集蒸馏水洗脱的组分，真空浓缩至 干，获得浓缩物b;将浓缩物b再通过中性氧化铝柱层析，先用正己烷，再用乙酸乙酯：石油 醚（1:1，v/v)洗脱，收集乙酸乙酯：石油醚的洗脱液，真空浓缩至干，获得浓缩物c;将浓缩 物c利用制备型TLC层析，以正丙醇：醋酸：水（8:2:l，v/v)为展开剂，利用氯-联甲苯胺 显色，回收与标准品相符的显色处硅胶，用体积浓度50%乙醇水溶液溶解后浓缩干燥即得 到1-脱氧野尻霉素，该方法的得率约为46%。所述浓缩物a，浓缩物b和浓缩物c均为浓 缩物，为了便于区分不同步骤获得的浓缩物而命名，字母本身没有含义。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株--紫红 曲霉浙工红曲1号，经发酵培养，可获取含有1-脱氧野尻霉素的培养物，1-脱氧野尻霉素具 有a-葡萄糖苷酶抑制活性；该菌株及其发酵获取含有1-脱氧野尻霉素培养物的方法具有 广阔的应用前景。 (四）
【附图说明】
[0017] 图1为紫红曲霉浙工红曲1号发酵产品分离纯化得到的1-脱氧野尻霉素的质谱 图。
[0018] 图2为基于ITS所构建的系统发育树。
[0019] 图3为1-脱氧野尻霉素标准品及紫红曲霉浙工红曲1号发酵产品的液相色谱 图，a为1-脱氧野尻霉素标准品；b为紫红曲霉浙工红曲1号发酵产品。 (五）
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0021] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试 验材料，如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店购买得到。下述实施例中的％，如无特殊 说明，均为质量百分含量。
[0022] 实施例1紫红曲霉浙工红曲1号的分离及鉴定
[0023] 一、浙工红曲1号的分离
[0024] 从杭州的粮食加工厂附近采集土壤样本，加无菌水稀释后涂布在筛选培养基平板 上，32°C培养2天，挑取符合红曲霉形态特征的菌落涂布筛选平板进一步分离纯化。将其中 一株生长快速、耐酸性强的红曲霉菌株记为浙工红曲1号，并采用形态学和分子进行鉴定。
[0025] 所述筛选培养基组成为：10°Bx麦芽汁，pH3. 5,琼脂1. 5%。
[0026]二、浙工红曲1号的形态学鉴定
[0027] 1、培养基
[0028] (1)每升察氏酵母提取粉琼脂培养基（CYA)组成：NaN03 3. 0g，K2HP04 1. 0g，KC1 0? 5g，MgS04 ? 7H2〇 〇? 5g，FeS04 ? 7H2〇 〇? 〇lg，酵母提取物 5. 0g，蔗糖 20g，琼脂 15g，加蒸 馏水至1L。
[0029] (2)每升麦芽提取粉琼脂培养基（MEA):麦芽提取粉20g，蛋白胨l.Og，葡萄糖 20g，琼脂15g，加蒸馈水至1L。
[0030] (3)每升完全培养基（CM):蔗糖100g，酵母提取物3. 0g，蛋白胨5. 0g，NaN03 2. 0g， K2HP04 1. 0g，MgS04 ? 7H20 0? 5g，KC1 0? 5g，FeS04 ? 7H200. 01g，琼脂 20g，加蒸馏水