鹿胎dna鉴定试剂盒及鉴定方法
【专利说明】鹿胎DNA鉴定试剂盒及鉴定方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及使用生物技术鉴定鹿胎与其易混品种DNA鉴定试剂盒及鉴定方法。
【背景技术】
[0003]鹿胎为鹿科动物的胎兽及胎盘。其原动物为鹿，鹿是鹿科动物的总称，属于哺乳类偶蹄目，目前世界上共有16属约52种，我国有9属16种。鹿属有梅花鹿(CervusnipponTemminck)、7K鹿(Cervus unicolor Kerr)、白唇鹿(C.albirostris Przewalski)、马鹿(C.elaphus L.)等。有茸用价值的梅花鹿、马鹿、白唇鹿、水鹿等称为茸用鹿，茸用鹿既是经济动物，也是药用动物，因此鹿的经济价值很高。梅花鹿为国家一级保护动物，梅花鹿是我国人工饲养的主要鹿种。梅花鹿分布在东北、华北、华东、华南和西南各地。其中东北地区的长白山、大小兴安岭地区，更是梅花鹿的产地。
[0004]鹿胎性味性温，味咸，无毒。据《本草纲目》记载“鹿胎调经养颜解诸毒”，具有补精血、返少阳的作用。鹿胎含有多种成分，主要含有多种氨基酸、维生素和钙、铁、锌多种微量元素。丰富的成分使鹿胎的药用价值很高。鹿胎为常用中药之一，在临床应用广泛。鹿胎膏是以鹿胎为原料，辅以人参，当归等多种珍贵药材及多道工序精心加工而成。具有较强的补气养血、调以散寒的功效，治疗妇女月经不调、宫寒不孕、崩漏带下等症。
[0005]由于鹿胎所含成分复杂，相近产品或假冒商品较多，用现有技术无法完全确定其真伪。而确保中药材的质量，对鹿胎真伪和质量鉴定至关重要。
[0006]分子遗传标记技术开始与中药领域渗透，并快速融合、发展，其中DNA指纹图谱在中药材(除矿物药外)的鉴定方面具有专属性强，准确性高，重复性好等优点，从分子水平解决了以前中药鉴定中宏观鉴定水平上的不完善。现代分子生物学在中药的质量控制领域逐步扩大，方法逐渐完善，大大加快了中药现代化的进程。
[0007]线粒体是存在于真核细胞内的一种细胞器，线粒体DNA (mitochondrial DNA,mtDNA)是一共价闭合的双链环状的遗传物质，具有分子量小、结构简单、易于分离、拷贝数高、突变率高、进化速度快、母性遗传、无组织特异性、高保守性等特点。分析种内和近缘种间遗传多样性和进化关系的适当的DNA片段，可应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究。因此，以线粒体DNA分子特征为遗传标记的中药鉴定更为准确、可靠。
[0008]我们依托吉林省科技厅(2008年I月立项)和吉林省教育厅资助课题(2010年I月立项):《中药DNA指纹检测试剂盒的研究与开发》(2012年5月吉林省科技厅鉴定成果)，基于线粒体DNA建立动物中药材的DNA指纹特征，成功开发出貂心、鹿鞭和鹿茸三种中药材DNA鉴定试剂盒。相关成果有:李明成，张丽华等《貂心DNA检测试剂盒及鉴定方法》，发明专利:ZL 200810051643.3 ；2011.4授权；《貂组织线粒体DNA及细胞色素b鉴定及特征》[张丽华，李明成等，吉林大学学报，2008，34 (5):790-793]，《中药材龟甲细胞色素b特异性鉴定研究》[刘同辉，张丽华等，中国药学杂志，2012，4(3): 182-185]。
[0009]目前国家标准中尚无鹿胎的法定鉴别方法，国内针对鹿胎及伪品的鉴别方法有药材性状鉴别、红外指纹图谱法。陈代贤，郭月秋，杨乐等人通过鹿胎的外形、大小、颜色、表皮特征、质地、断面特征、气味等宏观特征来判断鹿胎真伪。陈代贤，郭月秋等，《鹿胎及其混伪品的性状鉴别研究》中药材[1997，5];杨乐，《鹿胶与鹿胎》医药养生保健报
[2007]。方法虽然简单，但经验在这种方法中的影响很大，主观性较强。即使进行了很详细的性状描述，再由其他人来判断也比较难。而且作为药材形态通常是不完整的，因此鉴定难度较大。郭月秋，陈代贤等，《鹿胎及其伪充品的免疫凝集试验鉴别》[1999，2]对鹿胎成分提取后利用免疫凝集试验鉴别鹿胎中药材，该方法尽管简单，但灵敏性和特异性都不高。
[0010]另外对于中药成分鉴别应用较多的方法是红外光谱法。中国专利申请号CN201110114818的《一种鹿胎的鉴定方法》是对取已知真品鹿胎粉和样品粉分别用KBr压片、测其红外光谱图，对两红外光谱图进行峰位、峰强度、峰形和波数的对比分析；不同则为赝品，相似或相同则用已知真品鹿胎粉和样品粉分别用正己烧、石油醚、甲醇、乙醇、乙醇与水混合物进行溶剂提取，其提取物分别测定其红外光谱图，用同一种溶剂提取物的真品与样品的红外光谱图两-两进行峰位、峰强度、峰形和波数的对比分析；5种溶剂提取物中有3种及3种以上红外光谱图对比分析中主要数据不相同则为赝品。只具有相对的鉴别意义，无法准确鉴定真伪，且操作繁琐。
[0011]在此基础上，本发明专利基于选择鹿的mtDNA特异位点用于鹿胎鉴别。从鹿类线粒体DNA的全部基因组进行筛选，采用高通量技术分析具有鉴别序列片段作为鉴别点，建立PCR反应体系，因无需对鹿胎原药成分进行逐一分离，方法可快速、简便，不失原药材本性地直接判断鹿胎的真伪。
【发明内容】
[0012]本发明专利采用生物信息学技术对梅花鹿线粒体DNA基因组进行筛选，利用Genbank中的相关信息，根据梅花鹿与其他相关动物的线粒体DNA序列的差异，选取特异性基因序列，应用primer premier 5.0设计软件，设计可有效地区分鹿胎和伪品的特异性DNA序列，利用PCR技术在一个反应体系中加入一对特异性引物，针对一个模板可扩增一个具有差异的目的片段。提供一种能够准确鉴别鹿胎和伪品特异性分子标志，使用方便的鹿胎和伪品PCR检测试剂盒，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点，并提供其简便、快速、检测结果可靠的鉴定方法。
[0013]本发明的目的是由以下技术方案来实现的:
一种鉴别鹿胎和伪品PCR检测试剂盒，其特征是，它包含:
1.样本前处理液
取待检样本(干品)lg，刷洗干净后用去离子水冲洗干净，室温干燥，用紫外灯照射30min以上。使用研钵将样品研碎至2?3mm左右，置于离心管中，每份按质量体积比1:20加入相应体积处理液(主要含有蔗糖，Tris-HCl, Na2EDTA)，56°C温浴振荡4h。后12000 r/min离心1min弃上清，沉淀待用。
[0014]取待检样本(鲜品)新鲜胎盘、胎膜、胎兽组织各lg，于小烧杯中加约1mL冷生理盐水溶液浸泡20min，在平皿中用手术刀去除结缔组织后将组织切碎，每份按质量体积比
I:20加入相应体积处理液(主要含有蔗糖，Tris-HCl, Na2EDTA)置于研钵中研磨。
[0015]2.线粒体DNA提取体系
(I)裂解液向经过前处理的样品中加入5ml裂解液[10 mmol/LTris-HCl (pH 8.0)， 10 mmol/LEDTA (pH 8.0)，100 mmol/L NaCl, 2% SDS, 40 μ g/ml 蛋白酶 K,
0.039mol/L DTT]，置于水浴锅中，56°C水浴过夜，转速100 r/min。
[0016](2)沉淀液直接向裂解后的样品中加入2ml沉淀液(主要含有NaAC)，充分混匀，6000 r/min 4°C离心lOmin，吸取上清，弃沉淀。向上清中加入等体积的预冷的异丙醇，混匀后，低温放置20?30min，12000 r/min 4°C离心20min，弃上清，留沉淀。
[0017](3)洗涤液使用洗涤液(主要含有70%乙醇)洗涤沉淀2?3次，干燥沉淀，溶于灭菌双蒸水中，-80 °C保存备用。
[0018]3.PCR反应体系
(a)鉴定反应体系总体系为100μ L，其中含有缓冲液10 μ L，12.5 mM dNTP4?10 yL,0.1mM鹿胎引物L 5?4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2?10 μ L，待测样品DNA2?5 μ L，余为双蒸馏水；
(b)阳性对照反应体系总体系为100μ L，其中含有缓冲液10 μ L，12.5 mM dNTP 4?10 yL,0.1mM鹿胎引物L 5?4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2?10 μ L，鹿胎DNA 2?5 yL，余为双蒸馏水；
(c)阴性对照反应体系总体系为100μ L，含有缓冲液10 yL，12.5 mM dNTP4?1yL,0.1 mM鹿胎引物1.5?4.0 μ L，Taq DNA聚合酶2?10 μ L，余为双蒸馏水；
(d)设计反应程序分别将鉴别鹿胎和伪品PCR检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各100 μ L加入反应管中，置于PCR反应仪(市场有售，任意型号)中按下列程序进行:94°C预变性3min?7 min,94°C 30s，退火温度 58°C Imin ?30s，72°C Imin ?30s，30 个循环，72°C延伸 5min ?8min，4°C。
[0019]4.结果判定体系
制备用1.5琼脂糖凝胶(市场有售，可购买)，电泳，分子量100?1500bp的DNA Marker(标准分子量，市场有售)作参照，凝胶成像分析系统(市场有售，可购买)观察和分析结果。
[0020]鹿胎DNA鉴定方法，其特征是，它包含以下步骤:
1.检测样本前处理
待检样本(干品)lg，刷洗干净后用去离子水冲洗干净，室温干燥，用紫外灯照射30min以上。使用研钵将样品研碎至2?3mm左右，置于离心管中，每份按质量体积比1:20加入相应体积处理液(主要含有蔗糖，Tr