专利名称：：假高粱及其近似种pcr鉴定方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及检疫性杂草假高粱及其近似种的种间鉴定
技术领域：
，是一种用于快速鉴定假高粱、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草的PCR方法及该方法所使用的试剂盒。
背景技术：
：假高粱是世界十大恶性杂草之一，我国已将其列入有害生物名单。假高粱的种子特征与拟高粱、苏丹草等Sorghum属其他种十分相似，加之口岸截获的假高粱种子由于小穗轴，颖壳等特征部位易被挤压而折断、破损，给以种子鉴定为主的口岸检疫工作带来更大困难，因此，检疫工作中急需一种可靠而快速的方法来解决这一难题。目前针对假高粱、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草这五个物种的鉴定手段除了形态学之外，还有郭琼霞(2006)等尝试过rDNAITS区的RFLP分析，可将假高粱与拟高粱区分开来(郭琼霞等，基于rDNAITS分析的假高粱鉴定方法[J].福建农业学报2006，21(1):32-34.)。此种鉴定方法的鉴定范围仅限于假高粱、拟高粱两个物种，比本发明的鉴定范围窄，且耗时长l倍左右。方雪恩等(2007)尝试用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)通过检测其醇溶蛋白以区分高粱、苏丹草、黑高粱、假高粱以及一种杂交苏丹草(方雪恩等，高粱属A-PAGE图谱的建立及在种子鉴定中的应用[J]，西北植物学报，2007，27(12):2399-2403)，该鉴定方法以醇溶蛋白提取为基础，本发明以DNA提取为基础，供PCR所消耗的样品量远少于醇溶蛋白研究的所需样品量，即本发明的样品消耗量比前述方法少，且操作步骤更简单，耗时更短。
发明内容本发明的目的在于提供一种准确快速鉴定假高粱、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草这五个物种的鉴定方法及该方法所使用的PCR分子鉴定试剂盒，鉴定的方法包括1.鉴别PCR;2.电泳检测。试剂盒中包括3对PCR反应引物和标准图谱。—种快速鉴定假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草的方法，包括提取种子DNA，普通PCR鉴别，PCR循环，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别与标准图谱对比，其特征在于所述的普通PCR鉴别步骤采用的引物为引物JH-1:5'-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3'弓I物JH-2:5'-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3'引物SK-1:5，-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3，弓I物SK-2:5，-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3，引物HS-1:5'-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3'引物HS-2:5'-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3'。前述方法中，所述的标准图谱比对包括如下步骤利用引物JH进行PCR反应，与JH标准图谱对比，若在250bp和280bp处产生条带，则受试样品为假高粱或黑高粱；利用引物SK进行PCR反应，与SK标准图谱对比，若在110bp处产生条带，则受试样品为丝克高粱；利用引物HS进行PCR反应，与HS标准图谱对比，若在250bp处有条带，则受试物种为黑高粱；若在llObp和130bp处均有条带，则受试物种为苏丹草；利用引物JH进行PCR反应，与JH及HS标准图谱对比，若在250bp、280bp两处均有特异条带，而此样品利用HS引物进行PCR反应未在250bp处产生特异条带，则受试样品为假高粱；利用引物SK、HS、JH分别进行PCR反应后，并与JH、SK及HS标准图谱对比，若都没有出现特异性的条带，则该受试物种为拟高粱。—种前述的快速鉴定假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草的方法所使用的PCR分子鉴定试剂盒，该试剂盒至少含有用于前述PCR反应的引物及标准图谱。本发明的优点在于可解决假高粱及其近似种鉴定的难题，能在8小时内完成假高粱、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草这五个物种的鉴定工作。图1是引物JHPCR电泳的标准图谱。图2是引物SKPCR电泳的标准图谱。图3是引物HSPCR电泳的标准图谱。图1至图3中数字1到5分别表示假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草，ck为清水对照，M为lOObpDNALadder。具体实施例方式—种快速鉴定假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草的方法，其特征是采用下列步骤对受试样品进行位点特异性PCR鉴别①种子DNA提取按常规进行，用双蒸水将受试样品模板DNA浓度调节至50ng/ul。②鉴别PCR:引物浓度用双蒸水溶解调节至10pmol/ul。以反应体积为20ul的剂量为参考点，各种物品的用量为IOXT叫DNA聚合酶缓冲液(15mMMgCl2)2uldNTP0.4ul引物各O.8ulTaqDNA聚合酶0.24UDNA模板0.8ul双蒸水加到20ul混匀后，瞬时离心。引物共三对4引物JH-1:5'-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3'引物JH-2:5'-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3'引物SK-l:5'-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3'引物SK-2:5，-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3，引物HS-l:5'-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3，引物HS-2:5'-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3，③PCR循环于PCR仪上，94。C3min，(94°C46s，52°Clmin，72min)40个循环，72°C60min，4。C结束。④非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳A.凝胶的灌制(1)玻璃板的清洗用洗洁精把玻璃板反复擦洗干净，用蒸馏水冲洗干净，放置干彻底干燥后，再进行玻璃板组装、灌胶。(2)玻璃板的组装将玻璃板组装好，有缝隙的一边用2.0%的琼脂糖(2g琼脂糖+98ml水)封住，将封好的玻璃板组装在电泳槽上待用。(3)6%非变性电泳凝胶的配置燥备用,<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>按照上述顺序加入各组分(TEMED—定要最后加入)，充分摇匀后将配好的胶轻轻灌入两玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口插入梳子，并防止梳子底部产生气泡。(要根据胶框选取合适的梳子，以防产生胶膜，影响点样)，若有漏出应及时补加聚丙烯酰胺溶液。置于气温让其聚合30min以上。B.扩增产物的电泳(1)电泳缓冲液待凝胶聚合后，在电泳槽中加入1XTBE的电泳缓冲液。(2)预电泳将梳子轻轻拔出，200V预电泳10-30min。(3)上样预电泳后，将PCR产物4ul和DNAloadingbuffer混合，用移液枪吸取混合液轻轻加入点样孔，尽量縮短加样时间。(4)电泳条件接上电源，电泳。参数为恒压200V，电泳1.5h，视DNA分子量大小及带型差异的可辨程度，调整电泳时间)。电泳结束后，切断电源，倒去电泳缓冲液，卸去玻璃板，去掉琼脂糖封胶，准备染色。C.扩增产物的快速银染法(1)固定在容器中混合10%乙醇100ml和500ul冰乙酸，摇匀后加入凝胶，摇3-5min。(2)染色1ml20%AgN03后平行摇5_8min。(3)漂洗倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗2-3次，洗净后倒掉蒸馏水。(4)显色混合100ml3%NaOH和500ul甲醛，迅速震荡，使显影液均匀作用，平行摇动，直至显影。(5)洗涤显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水洗凝胶1-2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。(6)用蒸馏水冲洗干净，吸干水，上面盖上保鲜膜，照相或扫描。⑤电泳图谱对比与JH标准图谱对比，使用引物JH，假高粱和黑高粱在250bp、280bp两处均有特异条带，丝克高粱、拟高粱、苏丹草均没有这两条条带。因此，利用引物JH进行PCR反应，若在250bp和280bp处产生条带，则受试样品为假高粱或黑高粱。与SK标准图谱对比，使用引物SK，丝克高粱在llObp处有特异条带，假高粱、黑高粱、拟高粱、苏丹草均无此带。因此，利用引物SK进行PCR反应，若在110bp处产生条带，则受试样品为丝克高粱。与HS标准图谱对比，使用引物HS，黑高粱在250bp处有特异条带，假高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草均无此带；苏丹草在110bp和130bp处均有特异条带，假高粱、黑高粱、丝克高粱、拟高粱均无。因此，利用引物HS进行PCR反应，若在250bp处有条带，则受试物种为黑高粱；若在110bp和130bp处均有条带，则受试物种为苏丹草。与JH及HS标准图谱对比，若利用引物JH进行PCR反应，在250bp、280bp两处均有特异条带，而此样品利用HS引物进行PCR反应未在250bp处产生特异条带，则受试样品为假高粱。与JH、SK及HS标准图谱对比，若都没有出现特异性的条带，则该受试物种为拟高粱。实施上述各步骤所使用的PCR分子鉴定试剂盒中包括有用于PCR反应的引物以及标准图谱。其中用于PCR反应的3对引物的DNA序列为JH-1:5'-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3'JH-2:5'-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3'SK-1:5'-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3，SK-2:5，-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3，HS-1:5'-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3，HS-2:5'-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3，。实施例11材料和方法1.1实验材料假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草种子，由福建出入境检验检疫局提供。1.2DNA提取取样品0.05g，经液氮速冻后研磨至粉末，加入500iilTES*，加50-100iig蛋白酶K，55-60。C温育0.5-lh，期间轻轻摇动混匀；调节NaCl浓度至1.4mol/L，加1/10体积10%CTAB，65°C10min;加入1体积氯仿异戊醇(24:l)，轻摇混匀，于(TC30min，之后4°C12000rpm离心10min;取上清，加入225iU5molNH4AC，混匀，放在冰上30min以上，4°C12000rpm离心10min;取上清，加3ii1Rnase，于37°C15min，4。C12000离心10min;取上清，加0.55体积异丙醇沉淀DNA，立即12000rpm离心5min，若无DNA团出现，立即置样品于冰上15-30min;弃上清，70%乙醇洗沉淀2次，干燥后溶解于50iUTE中。(*注3:TES:100,1/LpH为8.0的Tris，1Ommol/LpH为8.0的EDTA以及2%SDS。)1.3PCR扩增引物名称正向引物反向引物退火温度SK5，-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3'5，-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3'52°CHS5，-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3，5，-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3'55°CJK5，-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3，5，-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3'58°C1.4非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1.4.1凝胶的灌制(1)玻璃板的清洗用洗洁精把玻璃板反复擦洗干净，用蒸馏水冲洗干净，放置干燥备用。彻底干燥后，再进行玻璃板组装、灌胶。(2)玻璃板的组装将玻璃板组装好，有缝隙的一边用2.0%的琼脂糖(2g琼脂糖+98ml水)封住，将封好的玻璃板组装在电泳槽上待用。(3)6%非变性电泳凝胶的配置组分用量30%丙烯酰胺6ml1XTBE24ml10%过硫酸铵200ulTEMED18ul终体积30ml7按照上述顺序加入各组分(TEMED—定要最后加入)，充分摇匀后将配好的胶轻轻灌入两玻璃板之间，当胶加到上部时，在灌胶口插入梳子，并防止梳子底部产生气泡。(要根据胶框选取合适的梳子，以防产生胶膜，影响点样)，若有漏出应及时补加聚丙烯酰胺溶液。置于气温让其聚合30min以上。1.4.2扩增产物的电泳(1)电泳缓冲液待凝胶聚合后，在电泳槽中加入1XTBE的电泳缓冲液。(2)预电泳将梳子轻轻拔出，200V预电泳10-30min。(3)上样预电泳后，将PCR产物4ul和DNAloadingbuffer混合，用移液枪吸取混合液轻轻加入点样孔，尽量縮短加样时间。(4)电泳条件接上电源，电泳。参数为恒压200V，电泳1.5h，视DNA分子量大小及带型差异的可辨程度，调整电泳时间)。电泳结束后，切断电源，倒去电泳缓冲液，卸去玻璃板，去掉琼脂糖封胶，准备染色。1.4.3扩增产物的快速银染(1)固定在容器中混合10%乙醇100ml和500ul冰乙酸，摇匀后加入凝胶，摇3-5min。(2)染色1ml20%AgN03后平行摇5_8min。(3)漂洗倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗2-3次，洗净后倒掉蒸馏水。(4)显色混合100ml3%NaOH和500ul甲醛，迅速震荡，使显影液均匀作用，平行摇动，直至显影。(5)洗涤显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水洗凝胶1-2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。(6)用蒸馏水冲洗干净，吸干水，上面盖上保鲜膜，照相或扫描。1.5电泳结果比对与JH标准图谱对比，使用引物JH，若在250bp和280bp处产生条带，则受试样品为假高粱或黑高粱。与SK标准图谱对比，使用引物SK，若在llObp处产生条带，则受试样品为丝克高粱。与HS标准图谱对比，使用引物HS进行PCR反应，若在250bp处有条带，则受试物种为黑高粱；若在llObp和130bp处均有条带，则受试物种为苏丹草。与JH及HS标准图谱对比，若利用引物JH进行PCR反应，在250bp、280bp两处均有特异条带，而此样品利用HS引物进行PCR反应未在250bp处产生特异条带，则受试样品为假高粱。与JH、SK及HS标准图谱对比，若都没有出现特异性的条带，则该受试物种为拟高粱。序列表〈110〉福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心〈120〉假高粱及其近似种PCR鉴定方法及其试剂盒〈140>200810072360.7〈141>2008-12-12〈160〉6<210>1〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的DNA〈400>JH-1ggaaggtcacaacctgcatc<210>2〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的DNA〈400>JH-2ccatctgttccttcccatct<210>3〈211>19〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的DNA〈400〉SK-1肪肌gc朋gcaacggg朋c<210>4〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的DNA〈400>SK-2ttttggccttcctcttggta〈210>5〈211>19〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的DNA9〈400>HS-1gcagctcagggac3朋tec〈210〉6<211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述::人工合成的DNA〈400>HS-2ctgcttcaggtaaggatcg10权利要求一种快速鉴定假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草的方法，包括提取种子DNA，普通PCR鉴别，PCR循环，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别与标准图谱对比，其特征在于所述的普通PCR鉴别步骤采用的引物为，引物JH-15’-GGAAGGTCACAACCTGCATC-3’引物JH-25’-CCATCTGTTCCTTCCCATCT-3’引物SK-15’-AAAAGCAAGCAACGGGAAC-3’引物SK-25’-TTTTGGCCTTCCTCTTGGTA-3’引物HS-15’-GCAGCTCAGGGACAAATAC-3’引物HS-25’-CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3’。2.如权利要求1所述的快速鉴定假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草的方法，其特征在于所述的标准图谱比对包括如下步骤，利用引物JH进行PCR反应，与JH标准图谱对比，若在250bp和280bp处产生条带，则受试样品为假高粱或黑高粱；利用引物SK进行PCR反应，与SK标准图谱对比，若在llObp处产生条带，则受试样品为丝克高粱；利用引物HS进行PCR反应，与HS标准图谱对比，若在250bp处有条带，则受试物种为黑高粱；若在llObp和130bp处均有条带，则受试物种为苏丹草；利用引物JH进行PCR反应，与JH及HS标准图谱对比，在250bp、280bp两处均有特异条带，而此样品利用HS引物进行PCR反应未在250bp处产生特异条带，则受试样品为假高粱；分别利用JH、SK及HS进行PCR反应，并与JH、SK及HS标准图谱对比，若都没有出现特异性的条带，则该受试物种为拟高粱。3.—种权利要求书1或2所述的快速鉴定假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草的方法所使用的PCR分子鉴定试剂盒，其特征在于该试剂盒至少含有用于权利要求1或2中所述的PCR反应的引物及标准图谱。全文摘要本发明涉及进境检疫性杂草种水平鉴定领域，是一种用于鉴定假高粱、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、苏丹草五个物种的鉴定方法及该方法所使用的试剂盒。鉴定的方法包括1.鉴别PCR；2.电泳检测。试剂盒中包括3对PCR反应引物和标准图谱。本发明的优点在于本发明可解决假高粱及其近似种鉴定的难题，提供一种在8小时内完成假高粱及其近似种的分子鉴定的试剂盒。文档编号C12Q1/68GK101748191SQ200810072360公开日2010年6月23日申请日期2008年12月12日优先权日2008年12月12日发明者沈建国,王念武,虞赟,郭琼霞,黄可辉,黄娴,黄振申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心