专利名称：：发酵柚苷酶的培养基及其制备和使用方法
技术领域：
：本发明涉及一种培养基，特别是涉及一种采用黑曲霉作为菌种，利用深层通风发酵技术发酵柚苷酶的培养基及其制备和^f吏用方法。
背景技术：
：柚苷酶具有重要的工业应用价值，它能够水解鼠李if唐苷产生鼠李糖[l],能够将普鲁宁水解成柚苷素及葡萄糖，在工业上可用降低芸香科果汁的苦味，能够水解葡萄中的键合态芳香物质而释放芳香物质，可用于改进传统的鼠李糖生产工艺。微生物发酵生产柚苷酶在国外早有报道，如，S.Elinbaum采用土曲酶固态发酵生产柚苷酶，Gallego采用深层培养生产柚苷酶等。国内有关用固态发酵生产柚苷酶的报导，但相对产量较低。
发明内容本发明的目的在于提供一种高产柚苷酶的发酵培养基配方。本发明的另一个目的在于提供一种操作简单的发酵柚苷酶的培养基的制备方法。本发明的第三个目的在于提供一种便于应用的发酵柚苷酶的培养基的使用方法。利用黑曲霉深层液态发酵生产柚苷酶的培养基及其使用方法。其主要内容包括(l)发酵培养基的配方组成；(2)培养基的配制；(2)培养基的使用。工艺所采用的菌种为黑曲霉。本发明是一种发酵柚苷酶的培养基，其组成及重量份为淀粉20-30g/L，柚皮苷2-10g/L，MgS040.2-1g/L，K跳0.5-2g/L,CaCl20.05-0.15g/L，(NH4)2S042-10g/L,ZnS04.7H200.03-0.1g/L，酵母膏O.5-6g/L，豆饼粉O.5-10g/L，pH6.0。本发明还提供了一种发酵柚苷酶的培养基的制备方法，该制备方法在配制培养基时，先按发酵培养基的计算，称取淀粉15-25g/L，MgS040.2-lg/L，KH2P040.5-2g/L，CaCl20.05—0.15g/L，(NH4)2S042-10g/L,ZnS04.7H200.03-0.1g/L,酵母膏0.5-4g/L，豆饼粉0.5-8g/L,pH6.0,加入发酵液总体积2/3-3/4的水，调pH至始培养基；将剩余的淀粉、柚皮苷、酵母膏、豆饼粉加入相当于最终发酵液体积1/4-1/3的水，灭菌后制成补料液。本发明还提供了一种发酵柚苷酶的培养基的使用方法，该方法是将菌种接至初始培养基中，在溶氧为2-40%,pH为5-6，温度为20-34。C的条件下培养，当总糖降到5g/L以下，以间歇补料、脉冲补料或流加的方式向培养液中补充补料液。有益效果采用上述技术方案后，以黑曲霉为菌种发酵生产柚普酶，整得发酵过程容易控制，操作筒单。在发酵前期(0-36h左右)，；徵生物快速生长，不容易产生污染，而发酵后期，柚苦酶不断地积累。本项目改进了柚苷酶的发酵培养基及其使用方法，使用该培养基，当发酵时间达到100h左右时，柚苷酶的产量达到了1100U/mL，或55000U/g干基，远远高于目前国内外研究所报导的柚苷酶发酵产量。此外，培养基的使用也十分的方便。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。图1A、图1B是本发明生产的柚皮苷标准品图谱及工作曲线图2A是本发明未添加样品一的空白色镨图2B、图2C、图2D是本发明添加样品一反应后的色谱图(n=3);图3A是本发明未添加样品二的空白色i普图3B、图3C、图3D是本发明添加样品二反应后的色i普图(n-3);图4A是本发明未添加样品三的空白色谱图4B、图4C、图4D是本发明添加样品三反应后的色语图(n=3)。具体实施例方式一、培#>基配方实例1:淀粉30g/L,柚皮芬10g/L，MgS(Ug/L,KH2P042g/L，CaCl20.15g/L,(亂S(U0g/L，ZnS04.7H200.1g/L，酵母膏6g/L，豆饼粉10g/L，pH6.0。4实例2:淀粉20g/L,柚皮苷2g/L，MgS040.2g/L，KH2P040.5g/L，CaCl20.05g/L，(NH4)2S042g/L，ZnS047H200.03g/L，酵母膏0.5g/L,豆饼粉0.5g/L，pH6.0。实例3:淀粉25g/L,柚皮苷6g/L0.1g/L，(NH4)2S046g/L，豆饼粉6g/L,pH6.0。实例4:淀粉20g/L，柚皮苷5g/L，MgS(U.5g/L,KH2PO0.lg/L,(NH4)2S044g/L,ZnS04.7H200.09g/L,豆饼粉2g/L,pH6.0。二、制备方法实例1:按照发酵液的总体积及配方"淀粉15g/L，MgS040.5g/L,KH2P041.5g/L,CaCl20.1g/L，(NH4)2S044g/L,ZnS04.7H200.09g/L，酵母膏2g/L，豆饼粉2g/L"计算各培养基成分的用量，称量并加入相当于发酵液总体积3/4的水，调pH至6.0，连续灭菌、冷却后输送进入发酵罐或输送进入发酵罐后灭菌后配成发酵初始培养基。按照发酵液的总体积及配方"淀粉5g/L，柚皮苷5g/L"计算并称量二者的用量，加入相当于发酵液总体积l/4的水，连续灭菌后送入补料罐或输送进入补料罐后再灭菌，制成补料液。上述的发酵初始培养基及补料液各成分量的计算方法以用10叱罐发酵为例，总发酵体积为8m3，则配制发酵初始培养需要淀粉=15g/Lx1000L/m3x8m3+1000g/kg=120kg,MgS04=0.5g/Lx1000L/m3x8m3+1000g/kg=4kg,KH2P04=1.5g/Lx1000L/m3x8m3+1000g/kg=12kg，CaCl2-0,1g/Lx1000L/m3x8m3+1000g/kg-0.8kg,(NH4)2S04=4g/Lx1000L/m3x8m3+1000g/kg=32kg,ZnS04.7H20=0.09g/Lx1000L/m3x8m3+1000g/kg=0.72kg,酵母膏=2g/Lx1000L/m3x8m3+1000g/kg=16kg，豆饼粉-2g/Lx1000L/m3x8m3+1000g/kg=16kg，水=8m、3/4=6m3。配制时，将以上成分称好混合均匀，调pH至6.0,用泵打入发酵罐，灭菌、冷却就制得发酵初始培养基。配制补料液需要淀粉=5g/Lx1000L/m3x8m3+1000MgS040.6g/L，KH2P041.3g/L，CaCl2ZnS04.7H200.07g/L，酵母膏3.3g/L，41.5g/L，CaCl2酵母膏2g/L,x1000L/m3x8m3+1000g/kg=40kg，水=8m3x1/4=2013水，灭菌后制成补料液。实例2按照发酵液的总体积及配方"淀粉23g/L,MgS041g/L，KH2P042g/L，CaCl20.15g/L，(NH4)2S0410g/L,ZnS04.7H200.1g/L,酵母膏4g/L,豆饼粉8g/L"计算各培养基成分的用量，称量并加入相当于发酵液总体积2/3的水，调pH至6.0,连续灭菌、冷却后输送进入发酵罐或输送进入发酵罐后灭菌后配成发酵初始培养基。按照发酵液的总体积及配方"淀粉7g/L，柚皮苷10g/L、酵母膏2g/L、豆饼粉2g/L"计算并称量各成分的用量，加入相当于发酵液总体积1/3的水，连续灭菌后送入补料罐或输送进入补料罐后再灭菌，制成补料液。发酵初始培养基及补料液各成分量的计算与实例l相同。实例3按照发酵液的总体积及配方"淀粉15g/L,MgS040.2g/L，KH2P040.5g/L,CaCl!0.05g/L，(NH4)2S042g/L，ZnS04.7H200.03g/L，酵母膏0.5g/L，豆饼粉O.5g/L"计算各培养基成分的用量，称量并加入相当于发酵液总体积3/4的水，调pH至6.0，连续灭菌、冷却后输送进入发酵罐或输送进入发酵罐后灭菌后配成发酵初始培养基。按照发酵液的总体积及配方"淀粉5g/L，柚皮苷2g/L"计算并称量各成分的用量，加入相当于发酵液总体积1/4的水，连续灭菌后送入补料罐或输送进入补料罐后再灭菌，制成补料液。发酵初始培养基及补料液各成分量的计算与实例l相同。实例4按照发酵液的总体积及配方"淀粉22g/L，MgS040.6g/L,KH2P041.3g/L，CaCl20.1g/L,(NH4)2S046g/L，ZnS04.7H200.07g/L,酵母膏3.3g/L，豆饼粉6g/L，，计算各培养基成分的用量，称量并加入相当于发酵液总体积3/4的水，调pH至6.0,连续灭菌、冷却后输送进入发酵罐或输送进入发酵罐后灭菌后配成发酵初始培养基。按照发酵液的总体积及配方"淀粉3g/L,柚皮苷6g/L"计算并称量各成分的用量，加入相当于发酵液总体积l/4的水，连续灭菌后送入补料罐或输送进入补料罐后再灭菌，制成补料液。发酵初始培养基及补料液各成分量的计算与实例1相同。三、使用方法实例1:使用时，将菌种接至初始培养基中，在溶氧为2%,PH为5,温度为20。C的条件下培养42h左右，总糖降至3g/L左右；此时，以间歇补料的方式，补料间隔为5h,分3次补完，总发酵时间为138h。实例2:使用时，将菌种接至初始培养基中，在溶氧为40%,pH为6.0，温度为34。C的条件下培养30h,总糖的浓度降至2.5g/L以下，恒速率流加补料液，稀释速率为O.05，总发酵时间为145h。实例3:将菌种接至初始培养基中，在溶氧为21%、pH为5.5、温度为27。C的条件下培养，36h后总糖降至2g/L,分4次进行间歇补料，补料的间隔时间为6h，总发酵时间120h。实例4:将菌种接至初始培养基中，在溶氧为30%、pH为6、温度为28。C的条件下培养，32h后总糖降至2g/L，分4次进行间歇补料，补料的间隔时间为6h，总发酵时间120h。四、柚普酶活力的检测方法及结果测试条件1、仪器美国Waters公司1525高效液相色谱仪。2、色谱条件SymmetryC18色谱柱(4.6x150mm,3.5^im，美国Waters7>司)。流动^目曱醇水=50%:50%;流速lmL/min;柱温35。C;进样量20pL，检测波长280nm。3、样品经3500r/min离心15min后取上清液进行酶反应，测定其分解柚皮苷的量以计算酶活。酶反应条件反应温度"。C，pH值4.0,底物浓度300ng/mL，加酶量0.lmL,反应时间15min。酶反应后的溶液经13000r/min高速离心10min后取上清液进行液相测定。4、柚皮苷标准对照品购自Sigma公司。5、柚苷酶活力的定义在40。C,pH值4.O的条件下，每lmL酶液每分钟反应分解柚皮苷的量(pg)为一个酶活力单位，1U=1(pg/mLmin)检测结果1、柚皮苷标准品及其标准工作曲线结果图谱见附件一。2、送检样品结果图谱及相关数椐见附件二。3、从色诸峰保留时间确定柚皮苦，与相应的空白溶液对照，计算出送检样品的酶活分别为(平均值)样品一1156.09U，样品二1250.29U，才羊品三1197.81U。1、未添加样品一的空白色谱图表表2ART(min)PeakType(V*sec)Height(V)%HeightIntegration■TypePoints人crossPeakSUrtTime(min)EndTime(min)12.382Unknown505880.3565840.43VB232.2672.65022.971Unknown1341292491.64146170794.82VV362.7673.36733.496Unknown4361482.98339022.20VB463.3674.15048.013Unknown7365105.03393972.56VB1827.63310.667添加样品一反应后的色谙图(n=3)表表2BRT(min)PeakTypeArea(V*sec)'MreaHeight(V)WeightIntegrationTypePointsAcrossPeakStartTime(min)EndTime(min)12.426Unknown187330.08"380.10BB242.2672.6836.8522.955Unknown16214956.8521660012.91BV202.7003.03333.147Unknown388798716.4440023323.85353.0333.61743.705Unknown825650.3562730.37VV203.0333.61754.121Unknown808470.3437110.22VV553.6173.96765.140Unknown娜O0.2134880.21VB503.9674.90077.922Unknown1791531275.7310463O462.34VB1877.50010.6178<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>添加样品二反应后的色谱图表(n=3)表3BRTPeak人r68%AreaHeightWfeightIntegrationPointsStartEnd(min)Type(V*sec)(V)TypeAcrossTimeTimePeak(min)(rain)12.960Unknown10481864.871356799.17VV202.7003.03323.154Unknown464075421.5847664232.21VV373.0333.65033.727Unknown931740.4369860.47VV213.6504.00044.150Unknown643880.3040150.27W304.0004.51755.180Unknown585920.2728710.19VB574.8505.,68.031Unknown1560119472.5485337557.68BB1977.50010.783表3CRT(min)PeakType人rsa(V*sec)%AreaHeight(V)歸ghtIntegratIonTypePointsAcrossPeakStartTime(u)irOEndTime12.435Unknown278850.1225400.16BV272.2672.71722.957Unknown9666094.171257037.88VV182.7173.03333.152Unknown471493220.3648114530.17W373.0333.65043.725Unknown972500.4273370.46VV213.6504.00054.147Unknown724530.3144940.28VV294.0004.48365.183Unknown622140.2739740.25VB534.9835.883了8,022Unknown1721558374.3496952160.80VB1947.55010.783表3DRT(min)PeakTypeArea似reaHeight(V)%HeightIntegrationTypePointsAcrossPeakStartTime(min)EndTime(迈in)12.436Unknown399240,1835300.23BV282.2672.73322.952Unknown9742644.461345668.77162.7333.01733.144Unknown472827321.6349191532.06373.0173.63343.709Unknown994700.4677650.51213.6333.98354.137Unknown694070.3244160.29333.9834.55065.163Unknown996180.4652630.34VB74.6675.90077.980Unknown1584719572.5088670857.80VB1977.50010.783103、未添加样品三的空白色谱图表表4ART(rain)PeakTypeArea(V*sec)'/UreaHeight(V)训eightIntegrationTypePointsAcrossPeakStartTime(min)EndTime(min)12.377Unknown489140.3463476347VB232.2672.65022.963Unknown1302787991.6814269241426924BV422.6673.36733.484Unknown4545893.203355633556VV633.3674.41744.mUnknown331030.2310750.07VB604.4175.41757.976Unknown6450444.54374072.49BB867.5008.933添加样品三反应后的色谱图(n-3)表表4BRT(min)PeakTypeArea(V*sec)%AreaHeight/'r、训eightIntegrationTypePointsAcrossPeakStartTime(min)End*rt__1l腦(rain)12.963Unknown7658513.161044906.50VV182,7173.03323.160Unknown337303113.9335154521.86VV353.0333.6173.719Unknown780630.3255820.35VV233.6174.00044.134Unknown389990.1626270.16VV284.0004.46755.156Unknown938300.3941730.26VB804.4675.81767.951Unknown1986209082.03114000670.88BB2007.43310.783表4CRT(min)PeakType(V*sec)%AreaHeight(V)%HeightIntegrationTypePoints▲crossPeakStartTimeEndTime(min)12.951Unknown10843954.561414418.63BV202.7003.03323.144Unknown368980815.5338832323.69VV353.0333.61733.701Unknown808510.3462040.38VV203.6173.96744.117Unknown471570.2030650.19VV253.9674.權5.144Unknown620360.2642640.26VB484.9505.76767.927Unknown1879430479.11109569466.85VB1997.45010.78311表4C<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1、一种发酵柚苷酶的培养基，其特征在于其组份及重量份如下淀粉20-30g/L，柚皮苷2-10g/L，MgSO40.2-1g/L，KH2PO40.5-2g/L，CaCl20.05-0.15g/L，(NH4)2SO42-10g/L，ZnSO4·7H2O0.03-0.1g/L，酵母膏0.5-6g/L，豆饼粉0.5-10g/L，pH6.0。2、根据权利要求书1所述的发酵柚香酶的培养基，其特征在于其组份及重量份如下淀粉20g/L，柚皮苷5g/L,MgS040.5g/L，K跳1.5g/L，CaCl20.lg/L,(NH4)2S044g/L，ZnS04'7H200.09g/L，酵母膏2g/L，豆饼粉2g/L,pH6.0。3、根据权利要求书1所述的发酵柚苷酶的培养基的制备方法，其特征在于(1)称取淀粉15-25g/L，MgS040.2-1g/L，KH2P040.5-2g/L，CaCl20.05-0.15g/L，(NH4)2S042—10g/L,ZnS04.7H200.03-0.1g/L,酵母膏0.5-4g/L,豆饼粉0.5-8g/L，pH6,0，加入发酵液总体积2/3-3/4的水，调pH至6.0，灭菌后配成发酵初始培养基；(2)将剩余的淀粉及柚皮苷加入相当于最终发酵液体积1/4-1/3的水，灭菌后制成补料液。4、根据权利要求书1所述的发酵柚苷酶的培养基的使用方法，其特征在于将菌种接至初始培养基中，在溶氧为2%-40%,pH为5-6,温度为20-34。C的条件下培养，当其中的碳源基本消耗完后，以间歇补料、脉沖补料或流加的方式向培养液中补充补料液。全文摘要本发明公开了一种发酵柚苷酶的培养基及其制备和使用方法，其组成为淀粉20-30g/L，柚皮苷2-10g/L，酵母膏0.5-6g/L，豆饼粉0.5-10g/L等。配制时，先按上述重量份，即配比称取大部分的淀粉、酵母膏、豆饼粉及其他原料，加入发酵液总体积2/3-3/4的水，调pH至6.0，灭菌后配成发酵初始培养基；将剩余的淀粉、酵母膏、豆饼粉及所有的柚皮苷加入相当于最终发酵液体积1/4-1/3的水，灭菌后制成补料液。利用该培养基及方法可制备出高产的柚苷酶，其产量可达到1100U/mL发酵液或55000U/g干基。文档编号C12N9/42GK101487001SQ200810072270公开日2009年7月22日申请日期2008年11月28日优先权日2008年11月28日发明者辉倪,李利君,肖安风,蔡慧农,黄高凌申请人:集美大学