专利名称：以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种以睾丸激素受体3(Testicular orphan nuclear receptor-3, TR3)为靶点的化合物(包 括激动剂和拮抗剂)筛选方法，其中涉及到一种应用于该筛选方法的检测TR3转录激活水平 的报告质粒(pNurRE-Luc)，此外，还涉及利用所述方法筛选获得的抗肿瘤和调节血糖化合物。
背景技术：
细胞核受体组成了一个受体超家族(nuclear receptor superfamily)，包括类固醇激素受体 (steroid receptor)、甲状腺激素受体(thyroid hormone rec印tor, TR)、维生素D3受体(vitamin D receptor, VDR)、视黄酸受体(retinoic acid receptor, RAR)以及近几年发现的数目众多的孤儿受 体(orphan receptor)。这些受体的共同特征是都具有在序列上高度保守的、由两个锌指结构组 成的DNA结合区及一个配体结合区。它们能够与特定DNA上的应答元件结合，调控特定基 因的转录和表达，从而在细胞的生长、分化和凋亡等生物学过程中发挥重要的调节作用 (Mangelsdorf D J , Thummel C ， Beato M ， et al . The nuclear receptor superfamily: the second decade [J]. Ce〃， 1995, 83 (6): 835-839)。
孤儿受体是指一类目前尚未发现其相应配体的核受体。现已发现的孤儿受体已达百种以 上，它们能够相互作用或者与其它转录因子相互作用，以调控不同基因的转录和表达。 TR3(Testicular orphan皿clear receptor-3)也称Nur77、 NGFI-B和NAK1 ，也是一种孤儿受体，它是 由立早基因(immediate early gene)NR4Al编码的蛋白，属于类固醇/甲状腺受体超家族。TR3 家族包括三个成员，分别为TR3、 Nurrl禾BNor-l，它们可以被血清及各种生长因子如表皮生 长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板生长因子(PDGF)或 者佛波酯等诱导表达，具有复杂的生物学功能，参与了细胞的增殖、分化、发育和凋亡过程。
1985年，Lau等人(Hazel T. Q Nathans D. & Lau L. F.. A gene inducible by serum growth factors encodes a member of the steroid and thyroid hormone receptor superfamily.尸roc. iVl^/. 爿cad Sd. t/.S.A, 1988， 85: 8444-8448)发现处于静息状态的小鼠细胞经血清和生长因子处理 后，在几分钟内有一批基因被诱导表达。他们在由这些立早基因构成的cDNA文库中克隆鉴定 出nur77基因。1989年，Chang等(Chang C., Kokontis J.， Liao S.S. & Chang Y. Isolation and
characterization of human TR3 receptor: a member of steroid receptor superfamily. J! <Stera/t/ 历oc&肌，1989,34:391-395)用针对类固醇激素受体超家族成员共有DNA结合序列为探针，在 人前列腺细胞的cDNA文库中分离到一个新的基因并命名为TR3。同年，Matson等(WatsonM.A. & Milbrandt J. The NGFI-B gene, a transcriptionally inducible member of the steroid receptor gene superfamily:genomic structure and expression in rat brain after seizure induction. Mo/. Ce// 5/o/.， 1989,9:4213-4219)在大鼠中发现了nur77的另一个同源物NGFI-B。
TR3家族成员在结构上具有核受体的典型特征，包括N端转录激活结构域(N-terminal transactivation domain)、中部DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD)和C末端配体结合 结丰勾域(ligand binding domain, LBD) (Eells JB, Witta J, Otridge JB， et al. Structure and function of the nur77 receptor subfamily, a unique class of hormone nuclear receptors [J].Cewf Ge"ow/cs， 2000， 1(2): 135-152.)。氨基末端转录激活区含有AF-l (activation function 1)功能激活域，其作用与启动 子的特殊序列相关；DNA结合区为高度保守的区域，其中含有两个锌指结构域(zinc finger domain)和C端延长区(carboxy-terminal extension, CTE)，可与耙基因启动子内的特异性DNA 序列(即激素应答元件)结合；配体结合区包含一个核定位信号(nuclear localization signal,NLS) 序列和三个核输出信号(nuclearexportsignal,NES)序列，决定了TR3的二聚化、与热休克蛋 白的结合、转录激活能力以及亚细胞定位等。序列分析表明，TR3蛋白的DNA结合区和配体 结合区与类固醇激素受体超家族成员同源，其配体结合区氨基酸序列与雌激素受体有20%的 同源性，而其DNA结合区则有55n/。的氨基酸序列与巳知类固醇受体同源。此外，TR3家族成 员具有高度同源的DBD和LBD的氨基酸序列，但N-末端转录激活结构域的氨基酸同源性相对 较〈氐(Davis I.J， Hazel T.Q Chen R.H, " a/. Functional domains and phosphorylation of the orphan receptor Nur77 [J]. Mo/五mfocn"o/, 1993, 7(8): 953-964)。
许多核受体能够识别位于靶基因启动子内的特异性DNA序列，这些特异性DNA序列称为 激素应答元件。TR3的DNA结合区能介导其与应答元件的结合，从而激活目的基因的转录。 TR3能够以单体形式结合到其应答元件(Nur77 binding response element, NBRE)上，NBRE 的序列为AAAGGTCA (Wilson T. E.,Fahmer T. J.， Johnston M. & Milbrandt J. Identification of the DNA binding site for NGFI-B by genetic selection in yeast. 1991, 252: 1296-1300)。
TR3还能够以同源二聚体形式结合NBRE相关序列的反向重复序列 -TGATATTTnmmnnAAATGCCA (n代表任意碱基)上，这个序列称为Nur77应答元件(nur77 response element, NurRE)。此外，TR3还能与其它蛋白形成异源二聚体结合到应答元件上， 激活基因的转录。TR3通过对下游基因转录的调控，可以实现调节血糖，抗肿瘤等方面的生物学功能。最 新研究成果表明，TR3及其另两个家族成员Nurrl和Nor-l在糖异生过程中具有关键作用。外源 表达TR3能够上调糖异生途径中几个重要基因的表达，包括葡萄糖-6-磷酸酶
(glucose-6-phosphatase, G6PC),果糖1,6-二磷酸酯酶1 (fructose-1,6國bisphosphatase l,FBPl ), 果糖l,6-二磷酸酯酶2 (fructose-1,6-bisphosphatase 2， FBP2)，以及烯醇化酶3 (enolase3, EN03)，从而提高禾几体血糖tK平(Pei， L. et al. NR4A orphan nuclear receptors are transcriptional regulatorsofhepaticglucosemetabolism. A^.A/ed 2006， 12:1048-1055)。此外，也有研究表明 TR3在激动剂或配体作用下可以通过受体依赖途径诱导肿瘤细胞凋亡。TR3能特异性结合在 E2F1 (transcriptionfactor 1)基因的启动子上，TPA(12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate)处理 后TR3上调了对E2F1基因的转录调控，并诱导了前列腺癌细胞LNcP的凋亡(Xiaomin Mu and Chawnshang Chang. TR3 Orphan Nuclear Receptor Mediates Apoptosis through Up-regulating E2F1 in Human Prostate Cancer LNCaP Cells. J5.C" 2003， 278:42840-42845); Stephen等人
(Sung Dae Cho, Kyungsil Yoon, Sudhakar Chintharlapalli, Maen Abdelrahim, Ping Lei, Stanley Hamilton, Shaheen Khan , Shashi K. Ramaiah， and Stephen Safe. Nur77 agonists induce proapoptotic genes and responses in colon cancer cells through nuclear receptor-dependent and nuclear receptor-independent pathways. Ca"cw Wes. 2007,67(2):674-683)研究发现用命名为 C-DIM的化合物及其结构类似物处理人结肠腺癌细胞RKO后，TR3的蛋白表达及转录激活水 平都得到显著提高，抑制了RKO细胞的增殖并诱导细胞凋亡。因此，建立以TR3为靶点的系 统,检测系列化合物对TR3转录激活水平的影响，筛选所得的激动剂或拮抗剂有可能是抗肿瘤， 调节血糖的潜在药物。
在真核细胞中检测核受体对下游基因表达的调控，可以采用荧光素酶(firefly luciferase) 报告体系。荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，1986 年萤火虫荧光素酶基因被用以测定基因表达的报告基因，并广泛使用。哺乳动物的细胞和组 织中无任何内源性的荧光素酶活力，因此它可以作为特异的、非常灵敏的遗传报告基因。在 荧光素酶的催化下，荧光素被氧化并释放一个光子，通过荧光分光光度计及液闪计数仪能够 对荧光作定量分析。荧光素酶基因作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度高(比其它报告 基因高30-1000倍)、费用低、不需使用放射性同位素等优点，因此广泛地应用在生物学和生 物医学等研究领域。本发明所述的筛选系统中将孤儿受体TR3的应答元件NurRE序列插入荧光 素酶报告基因的启动子上游，由此检测的荧光素酶表达水平即反映了TR3应答元件(NurRE)的 转录激活水平。该筛选系统特异性地以TR3为靶点，并具备反应灵敏，无须瞬时转染等优点，
可以实现高通量的以TR3为靶点初步筛选和评价抗肿瘤及调节血糖等化合物的目的。
发明内容
本发明旨在提供一种以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法。
本发明的另一目的在于提供以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法中报告质粒 pNurRE-Luc的构建方法以及细胞株的筛选方法，筛选出的化合物可应用于血糖调节和抗肿瘤 药物的相关研究。
本发明所述的以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法包括以下步骤
1) 构建一种含TR3应答元件(Nur77 response element, NurRE)及荧光素酶(luciferase, Luc) 报告基因的报告质粒pNurRE-Luc;
2) 筛选稳定表达报告质粒pNurRE-Luc的细胞株；
3) 筛选调节TR3转录激活水平的化合物。
所述构建一种含TR3应答元件及荧光素酶报告基因的报告质粒pNurRE-Luc的具体步骤 如下
1) 合成具备酶切识别位点的含TR3应答元件序列的片段；
2) 将含TR3应答元件序列的片段克隆至质粒pGL3-promoter的荧光素酶基因前的多克隆 位点内，获得质粒pGL3-NurRE;
3) 以质粒pGL3-NurRE为模板，PCR扩增出含fl复制起始位点(fl复制起始位点，简称 为fl W7')、 TR3应答元件、SV40启动子(SV40 promoter)、荧光素酶报告基因(luc gene)和终止 子(polyA)的片段，并将该片段插入到质粒pEGFP-C3内，获得含TR3应答元件及报告基因的 报告质粒pNurRE-Luc。
在步骤l)中，含TR3应答元件序列的片段序列如下3,。
在步骤3)中，PCR扩增所用的引物对的碱基序列如下
正向引物5，隱GATCGTGCACGCCCAAGCTACCATGATAAG - 3'(下划线标注的序列为限 制性内切酶々^Z I的酶切位点)；
反向引物5，陽CTGAGTGCACAGATCGCTGAGATAGGTGC - 3，(下划线标注的序列为限 制性内切酶^7a丄I的酶切位点)。
报告质粒pNurRE-Luc的核心序列为荧光素酶(Luc)报告基因、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因、新霉素抗性(NeoR, Neomycin-resistance)基因和TR3应答元件
序列组成的重组DNA序列，或者通过所述含TR3应答元件序列的片段序列中的核苷酸的缺 失、取代或增加而得到的核苷酸序列。上述报告质粒pNurRE-Luc的核心序列的连接顺序为 TR3应答元件序列一荧光素酶报告基因一绿色荧光蛋白基因一新霉素抗性基因，其中新霉素 抗性基因可应用于转染后的稳定表达细胞株的筛选，绿色荧光蛋白基因可作为检验瞬时转染 内参以平衡转染效率。报告质粒pNurRE-Luc中，荧光素酶基因表达受TR3应答元件调控， 因此，荧光素酶基因的表达水平即反映了 TR3应答元件的转录激活水平。 所述筛选稳定表达报告质粒pNurRE-Luc的细胞株的具体步骤如下
1) 以脂质体方法将报告质粒pNurRE-Luc转染细胞；
2) 通过检测表皮生长因子(EGF)对细胞克隆株的荧光素酶表达影响程度，在含终浓度 200 500 jag/ml新霉素(geneticin G418)的抗性培养基筛选出稳定表达报告质粒pNurRE-Luc的
细胞克隆株。
所述细胞克隆株包括人胚肾293细胞、人胚肾293T细胞、鼠肝AML-12细胞，以及人 胃腺癌BGC-823细胞，肝癌HepG2细胞等。
所述筛选调节TR3转录激活水平的化合物可采用瞬时转染报告质粒pNurRE-Luc的方法， 包括以下步骤
(1) 将细胞株接种在培养板培养；
(2) 以磷酸钙沉淀法瞬时转染报告质粒pNurRE-Luc;
(3) 去除培养基，加入含待测化合物的培养基；
(4) 处理细胞后，去除培养液，加入细胞裂解液进行细胞裂解；
(5) 用化学发光检测仪测定细胞裂解液的荧光素酶活性，即筛选出调节TR3转录激活水平 的化合物。
所述筛选调节TR3转录激活水平的化合物还可采用应用稳定表达报告质粒pNurRE-Luc
的细胞株的方法，包括以下步骤
(1) 将细胞株接种在培养板培养；
(2) 去除培养基，加入含待测化合物的培养基；
(3) 处理细胞后，去除培养液，加入细胞裂解液进行细胞裂解；
(4) 用化学发光检测仪测定细胞裂解液的荧光素酶活性，即筛选出调节TR3转录激活水平 的化合物。
本发明所述的以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法，构建了一种应用于检测TR3 转录激活水平的报告质粒(pNurRE-Luc)，并包含细胞培养和转染、荧光素酶活性分析等内容。
运用该筛选方法可以检测不同化合物对TR3转录激活水平的影响，以及不同浓度的化合物对 TR3转录激活水平的影响，从而筛选调节TR3转录激活水平的化合物(包括激动剂和拮抗剂)。 由于TR3可以通过调控下游基因的转录实现对血糖调节、抗肿瘤方面的生物学功能，因此该 化合物筛选方法可用于筛选及评价以睾丸激素受体3(TR3)为耙点的调节血糖化合物，以及以 睾丸激素受体3(TR3)为靶点的抗肿瘤化合物，不仅特异性好，反应灵敏，还具有简便、快速、 高通量、高效及评价指标直观等优点。
图1为报告质粒pNurRE-Luc结构图。在图1中，(PCMV-IE:巨细胞病毒即早期启动子， 是一种常用病毒来源的启动子；fl on': fl复制起始位点；SV40promoter: SV40启动子；SV40 polyA:来自SV40病毒T抗原的mRNA加尾信号；Kanr/Neor:新霉素抗性基因；Luciferase gene:荧光素酶报告基因；EGFP:绿色荧光蛋白基因；酶切位点5am/H， I4pa/I)。
图2为报告质粒pNurRE-Luc酶切鉴定图。在图2中，M: GeneRulerTMDNALader Mix; 1: v4; a丄I单酶切质粒pNurRE-Luc; 2: Sac I单酶切质粒pNurRE-Luc;图右侧数字代表其所 对应DNA片段的大小，单位为bp，从上到下依次代表IO， 000bp， 8000bp， 6000bp， 5000bp， 4000bp， 3500bp， 3000bp。
图3为激动剂对TR3转录激活水平的影响。在图3中，横坐标为不同实验组中激动剂的 浓度(agonist) /M，纵坐标为相对转录活性(RLU); BGC LUC指BGC细胞中进行的荧光 素酶报告基因表达水平检测实验，该实验也称为萤火虫反应。
图4为系列化合物对TR3转录激活水平的影响。在图4中，横坐标为系列化合物的种类， 每个化合物有两个浓度，口为10—7M，國为10—6M，单位为M;纵坐标为相对转录活性(RLU); BGC LUC指BGC细胞中进行的荧光素酶报告基因表达水平检测实验，该实验也称为萤火虫 反应。
具体实施例方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。 实施例1:构建报告质粒pNurRE-Luc (a)构建报告质粒pNurRE-Luc
(1) 合成两端分别带@ I和5g/ II酶切识别位点的含NurRE序列的片段，合成的NurRE 片段的碱基序列如下
(2) 将上述含NurRE序列的片段克隆至质粒pGL3-promoter荧光素酶基因前的多克隆位 点，构建重组质粒pGL3-NurRE，具体步骤为
/Qw I和SgZ II双酶切载体质粒pGL3-promoter，纯化回收所得酶切片段，按1:3比例与 含NurRE序列的片段用T4连接酶连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5，筛选重组质粒 pGL3-NurRE。
(3)以上述重组质粒pGL3-NurRE为模板，PCR克隆出含fl复制起始位点(简称为fl on')、 TR3应答元件(NurRE)、 SV40启动子(SV40 promoter)、荧光素酶报告基因(luc gene)和终止子 (polyA)的总长约3.5 Kb的片段，PCR产物胶回收后用^ a￡ I酶切，同时用^; a丄I酶切载体 质粒pEGFP-C3，获得约4.7Kb的载体片段。将上述3.5 Kb以及4.7 Kb的酶切片段两者纯化 回收后，以1:8的比例用T4连接酶连接，转化到大肠杆菌DH5a，筛选报告质粒pNurRE-Luc (参见图1所示的报告质粒pNurRE-Luc结构图)。
PCR扩增引物对的碱基序列如下
正向引物5 ， -GATCGTGC ACGCCC AAGCTACC ATG ATAAG-3 ，(下划线标注的序歹ij为限 制性内切酶々"丄I的酶切位点)；
反向引物5，-CTGAGTGCACAGATCGCTGAGATAGGTGC-3，(下戈j线标注的序列为限制 性内切酶^ a丄/的酶切位点)。
(b)酶切鉴定报告质粒pNurRE-Luc (参见图2所示的报告质粒pNurRE-Luc酶切鉴定图)。
(1) /单酶切质粒pNurRE-Luc，得到总长约8.2 Kb的酶切片段；
(2) 々7"丄I单酶切酶切质粒pNurRE-Luc，得到两条酶切片段分别约为4.7 Kb和3.5 Kb。 实施例2:筛选稳定表达报告质粒pNurRE-Luc细胞株
细胞株包括人胚肾293细胞、人胚肾293T细胞，鼠肝AML-12细胞，以及人胃腺癌 BGC-823细胞，肝癌HepG2细胞等。以人胃腺癌细胞BGC-823为例，筛选稳定表达报告质 粒pNurRE-Luc的细胞克隆株的具体方法如下
(1) 以脂质体转染方法将报告质粒pNurRE-Lnc转染细胞，培养液为DMEM培养基；
(2) 转染48h后，消化细胞，转接到60mm的细胞培养皿中，培养液为RPMI-1640培养 基(含10%FBS);
(3) 在培养液中加入G418(终浓度为300 pg/ml)进行细胞筛选，每间隔3 d更换一次培养液， 培养液为RPMI-1640培养基(含10% FBS， G418终浓度为300 pg/ml);
(4) 大约2 w后，单克隆细胞形成,挑取单克隆细胞至24孔培养板(l个克隆/ L)， 37 °C、 5%<:02培养数天，待细胞长满后再分批传代；
(5) 细胞培养24h后，加入EGF (终浓度为100ng/mD，对照组不加EGF， 3h后裂解细 胞，测定裂解液的荧光素酶活性，EGF剌激时的荧光素酶表达量比未刺激时的荧光素酶表 达量大幅增强的克隆细胞株则为阳性细胞株；
(6) 将阳性细胞株按步骤(4)和(5)再重复两次筛选，其中荧光素酶表达量增强最明显 的克隆细胞株即为阳性细胞株，获得的阳性细胞株进一步培养、扩种后， 一部分冻存于液氮， 一部分用于后续实验。
实施例3:筛选调节TR3转录激活水平的化合物
A.通过瞬时转染报告质粒pNurRE-Luc，检测不同因素(包括化合物、生长因子等)对真核 细胞内TR3的转录激活水平的影响，筛选调节TR3转录激活水平的化合物。以不同浓度的化 合物对TR3转录激活水平影响的检测为例(参见图3所示的激动剂对TR3转录激活水平的影 响)，具体步骤如下
(1) 将细胞株接种在96孔培养板，RPMI-1640培养基(含10% FBS)、 37。C和5% 032条件 下培养；
(2) 24 h后以磷酸钙沉淀法瞬时转染报告质粒pNurRE-Luc;
(3) 继续培养18 h后，去除培养基，根据需要加入含不同浓度化合物的新鲜RPMI-1640 培养基(不含FBS)，每个浓度设定3个平行样；
(4) 根据需要处理细胞数小时后，去除培养液，加入细胞裂解液进行细胞裂解；
(5) 用化学发光检测仪测定细胞裂解液的荧光素酶活性，该活性即代表TR3转录激活水平。
B应用稳定表达报告质粒pNurRE-Luc的细胞株，测定系列化合物对真核细胞内TR3的 转录激活水平的影响，从而筛选TR3的激动剂或拮抗剂。
以胃癌BGC-823细胞为例，检测化合物对TR3转录激活水平的影响(参见图4所示的系 列化合物对TR3转录激活水平的影响)，具体步骤如下
(1) 将稳定表达pNurRE-Luc报告基因的细胞株接种至96孔板培养，培养液为RPMI-1640 培养基(含10%FBS);
(2) 培养18h后，吸掉培养基，根据需要加入含不同浓度化合物的RPMI-1640培养基(不 含FBS)。每个浓度设定3个平行样；
(3) 根据需要处理细胞数小时后，洗掉培养液，并加入细胞裂解液进行细胞裂解；
(4) 用化学发光检测仪测定细胞裂解物的荧光素酶活性，该活性代表TR3转录激活的水平。
权利要求
1.以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法，其特征在于包括以下步骤1)构建一种含TR3应答元件及荧光素酶报告基因的报告质粒pNurRE-Luc；2)筛选稳定表达报告质粒pNurRE-Luc的细胞株；3)筛选调节TR3转录激活水平的化合物。
2. 如权利要求1所述的以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法，其特征在于所述构 建一种含TR3应答元件及荧光素酶报告基因的报告质粒pNurRE-Luc的具体步骤如下1) 合成具备酶切识别位点的含TR3应答元件序列的片段；2) 将含TR3应答元件序列的片段克隆至质粒pGL3-promoter的荧光素酶基因前的多克隆 位点内，获得质粒pGL3-NurRE;3) 以质粒pGL3-NurRE为模板，PCR扩增出含fl复制起始位点、TR3应答元件、SV40 启动子、荧光素酶报告基因和终止子的片段，再插入到质粒pEGFP-C3内，获得含TR3应答 元件及报告基因的报告质粒pNurRE-Luc。
3. 如权利要求2所述的以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法，其特征在于在步骤 1)中，含TR3应答元件序列的片段序列如下3,。
4. 如权利要求2所述的以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法，其特征在于在步骤 3)中，PCR扩增所用的引物对的碱基序列如下正向引物5，-GATCGTGCACGCCCAAGCTACCATGATAAG - 3,，下划线标注的序列为 限制性内切酶^ a￡ I的酶切位点；反向引物5，-CTGAGTGCACAGATCGCTGAGATAGGTGC - 3，，下划线标注的序列为 限制性内切酶々7"丄I的酶切位点。
5. 如权利要求1所述的以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法，其特征在于报告质 粒pNurRE-Luc的核心序列为荧光素酶报告基因、绿色荧光蛋白基因、新霉素抗性基因和TR3 应答元件序列组成的重组DNA序列；或通过所述含TR3应答元件序列的片段序列中的核苷酸的缺失、取代或增加而得到的核苷 酸序列。
6. 如权利要求5所述的以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法，其特征在于所述报 告质粒pNurRE-Luc的核心序列的连接顺序为TR3应答元件序列一荧光素酶报告基因一绿色 荧光蛋白基因一新霉素抗性基因。
7. 如权利要求1所述的以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法，其特征在于所述筛 选稳定表达报告质粒pNurRE-Luc的细胞株的具体步骤如下1) 以脂质体方法将报告质粒pNurRE-Luc转染细胞；2) 通过检测表皮生长因子对细胞克隆株的荧光素酶表达影响程度，在含终浓度200 500 Hg/ml新霉素的抗性培养基筛选出稳定表达报告质粒pNurRE-Luc的细胞克隆株。
8. 如权利要求7所述的以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法，其特征在于所述细 胞克隆株包括人胚肾293细胞、人胚肾293T细胞、鼠肝AML-12细胞，以及人胃腺癌BGC-823 细胞，肝癌HepG2细胞。
9. 如权利要求1所述的以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法，其特征在于所述筛 选调节TR3转录激活水平的化合物采用瞬时转染报告质粒pNurRE-Luc的方法，包括以下步 骤(1) 将细胞株接种在培养板培养；(2) 以磷酸钙沉淀法瞬时转染报告质粒pNurRE-Luc;(3) 去除培养基，加入含待测化合物的培养基；(4) 处理细胞后，去除培养液，加入细胞裂解液进行细胞裂解；(5) 用化学发光检测仪测定细胞裂解液的荧光素酶活性，即筛选出调节TR3转录激活水平 的化合物；
10. 如权利要求1所述的以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法，其特征在于所述 筛选调节TR3转录激活水平的化合物采用应用稳定表达报告质粒pNurRE-Luc的细胞株的方 法，包括以下步骤(1) 将细胞株接种在培养板培养；(2) 去除培养基，加入含待测化合物的培养基；(3) 处理细胞后，去除培养液，加入细胞裂解液进行细胞裂解；(4) 用化学发光检测仪测定细胞裂解液的荧光素酶活性，即筛选出调节TR3转录激活水平 的化合物。
全文摘要
以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法，涉及一种以睾丸激素受体3为靶点的化合物筛选方法。构建一种含TR3应答元件及荧光素酶报告基因的报告质粒pNurRE-Luc，筛选稳定表达报告质粒pNurRE-Luc的细胞株，筛选调节TR3转录激活水平的化合物。由于TR3可以通过调控下游基因的转录实现对血糖调节、抗肿瘤方面的生物学功能，因此该化合物筛选方法可用于筛选及评价以睾丸激素受体3为靶点的调节血糖化合物，以及以睾丸激素受体3为靶点的抗肿瘤化合物，不仅特异性好，反应灵敏，还具有简便、快速、高通量、高效及评价指标直观等优点。
文档编号C12Q1/66GK101372708SQ20081007195
公开日2009年2月25日 申请日期2008年10月17日 优先权日2008年10月17日
发明者刘晶晶, 乔 吴, 沈月毛, 郑忠辉 申请人:厦门大学