专利名称：一种用纳米金检测dna突变的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测DNA突变的方法，尤其是涉及一种用纳米金探针检测DNA突变的 方法。
背景技术：
基因突变是指基因组DNA分子在结构功能上发生碱基对组成或排列顺序的改变，主要 包括碱基的替换、缺失或插入。由于基因突变与多种遗传性疾病、肿瘤的发生具有密切的关 系，因此检测基因突变对于遗传性疾病或者肿瘤的早期发现和诊断具有重要的意义。
检测基因突变的方法主要有凝胶电泳法、DNA测序法和DNA芯片技术。凝胶电泳法 的基本原理是不同构象的DNA在凝胶中的迁移率不同，根据迁移率的改变与否，可以判 断是否存在基因突变。这种方法虽然简单，但是其灵敏度易受到电泳条件和DNA片段大小 等因素的影响，重现性较差，也不易实现自动化。DNA测序法是检测基因突变最直接最准确 的方法，它既可以确定突变的类型，又可以确定突变的位置。但是该种方法需要特殊的仪器 设备，且耗时费力，测序时需要同位素或者荧光标记，花费昂贵。DNA芯片技术是20世纪 90年代发展起来的一项新技术，其基本原理是许多已知序列DNA被排列在集成电路板上， 彼此之间重叠一个碱基，并覆盖整个所需检测的基因，荧光标记的正常DNA和突变DNA分 别与两块DNA芯片杂交，由于至少存在一个碱基的差异，正常DNA和突变DNA将会得到 不同的杂交图谱，通过共聚焦显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是 否存在突变。这种方法自动化程度高，可以检测大量的样品，但是需要特殊的仪器，成本也 较高。因此尚需找到更加简单快捷、高效灵敏、成本低廉的检测基因突变的方法。
纳米物质所表现出独特的光学性质、电学性质、磁学性质和热学性质受到了广泛的关注 和研究。美国西北大学Mirkin CA领导的研究小组，利用纳米金优良的光学性质，在检测DNA 方面做了大量卓有成效的研究。他们将巯基化的DNA序列固定在纳米金的表面，然后与目 标DNA进行杂交，杂交后纳米金的颜色和紫外可见吸收光谱会发生明显改变，据此可以判 断是否存在目标DNA序列(1. Elghanian R,Storhoff JJ, Mucic RC， et al. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science, 1997， 277(5329):1078-1081; 2. Taton TA, Mirkin CA， Letsinger RL.Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes. Science, 2000, 289(5485):1757-1760)。
发明内容
本发明的目的是提供一种用纳米金探针检测DNA突变的方法。 本发明的具体步骤如下
1) 将野生型单链DNA、与野生型单链DNA序列完全互补的探针和纳米金混匀，静置后 加入氯化钠溶液，混匀后静置，得到的体系称为体系l;
2) 将突变型单链DNA、与野生型单链DNA序列完全互补的探针和纳米金混匀，静置后 加入氯化钠溶液，混匀后静置，得到的体系称为体系2;
3) 往步骤1所得的体系1中加入氯化钠溶液，混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的 520 nm处的吸光值称为吸光值1;
4) 往步骤2所得的体系2中加入氯化钠溶液，使氯化钠的终浓度与步骤3中氯化钠的终 浓度相同，混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值2;
5) 当吸光值2与吸光值1有明显差异时，可以判断有突变存在。 所述的纳米金的粒径范围为5 50nm。
野生型单链DNA、与野生型单链DNA序列完全互补的探针和纳米金的加入量最好为野 生型单链DNA :纳米金=(10 50) pmol : (40 50) pL，与野生型单链DNA序列完全互 补的探针与野生型单链DNA等量，氯化钠的终浓度最好为0.05 0.1 mol/L。
突变型单链DNA、与野生型单链DNA序列完全互补的探针和纳米金的加入量最好为突 变型单链DNA :纳米金=(10 50) pmol : (40 50) ^L，与野生型单链DNA序列完全互 补的探针与突变型单链DNA等量，氯化钠的终浓度最好为0.05~0.1 mol/L。
在步骤3)中，氯化钠的终浓度最好为0.2 0.3mol/L。
本发明的技术方案所涉及的原理是纳米金在水溶液中可稳定分散，呈酒红色，但高盐 溶液对纳米金的稳定性影响很大，加入高盐溶液后，纳米金的稳定性被破坏，纳米金颗粒互 相聚结沉淀，纳米金的颜色和紫外可见吸收光谱最大吸收峰发生改变。纳米金对单链DNA 和双链DNA的吸附能力不同，在高盐溶液中单链DNA和双链DNA对纳米金的稳定性具有 显著不同的保护作用。单链DNA能结合到纳米金表面形成保护层，'使纳米金在高盐溶液中 聚集程度较小，520 nm处的吸光值变化不大；而双链DNA几乎不能附着在纳米金表面，无 法阻止纳米金在高盐溶液中发生聚集，520nm处的吸光值发生明显的改变。将探针分别与野 生型DNA和突变型DNA杂交，由于突变型DNA不能与探针完全互补，因此其杂交效率将 低于野生型DNA，其杂交体系中残留的游离单链DNA将高于野生型DNA杂交体系，从而
对纳米金的稳定产生更强的保护作用。因此，通过比较520nm处吸光值的改变程度可以判断 是否存在突变。本发明中DNA和纳米金均无需作任何修饰，大大简化样品的处理过程和操 作步骤，只需检测As2o的不同，即可判定DNA是否存在突变，最低检出限为10pmol，在40min 左右获得检测结果，具有简便快速、成本低廉、高度灵敏等特点，具有较大的临床应用潜力。
图1为本发明实施例所使用纳米金的透射电镜图。在图1中，标尺为50nm。
图2为野生型单链DNA与完全互补的探针杂交后，再加入氯化钠溶液，纳米金聚沉的 透射电镜图。在图2中，标尺为50nm。
图3为人p53基因密码子245处野生型和突变型DNA分别与纳米金探针杂交，再加入 氯化钠溶液所得体系的紫外可见吸收光谱检测结果。
图4为人p53基因密码子245处野生型和突变型DNA分别与纳米金探针杂交，再加入 氯化钠溶液所得体系的紫外可见吸收光谱检测结果。
图5为人p53基因密码子245处野生型和突变型DNA分别与纳米金探针杂交，再加入 氯化钠溶液所得体系的紫外可见吸收光谱检测结果。
图6为人p53基因密码子282处野生型和突变型DNA分别与纳米金探针杂交，再加入 氯化钠溶液所得体系的紫外可见吸收光谱检测结果。
图7为人p53基因密码子282处野生型和突变型DNA分别与纳米金探针杂交，再加入 氯化钠溶液所得体系的紫外可见吸收光谱检测结果。
图8为人p53基因密码子282处野生型和突变型DNA分别与纳米金探针杂交，再加入 氯化钠溶液所得体系的紫外可见吸收光谱检测结果。
在图3 8中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光值。曲线a为纳米金的紫外可见吸收光 谱，b为突变型单链DNA与纳米金探针体系的紫外可见吸收光谱，c为野生型单链DNA与 纳米金探针体系的紫外可见吸收光谱。
具体实施例方式
下面通过实施例结合附图对本发明作进一步说明。 实施例1
将该检测方法应用于检测人p53基因密码子245处的点突变，碱基G突变为碱基A^(参 见文献Rangel-Lopez A, Maldonado-Rodriguez R， Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005， 15(8):1-13)，具体操作步骤如下 1) 将野生型单链DNA 50 pmol、等量的与野生型单链DNA序列完全互补的探针探针(与 野生型单链DNA完全互补的序列)和50 7.54 nmol/L的纳米金混匀，室温静置lOmin后 加入3pL lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.057，混匀后室温静置30min，得到的体 系称为体系1。
2) 将突变型单链DNA 50 pmol、等量的与野生型单链DNA序列完全互补的探针探针(与 野生型单链DNA完全互补的序列)和50 7.54 nmol/L的纳米金混匀，室温静置lOmin后 加入3^L lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.057，混匀后室温静置30min，得到的体 系称为体系2。
3) 往步骤1所得的体系1中加入10 lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.206， 混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值1。
4) 往步骤2所得的体系2中加入10 lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.206， 混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520 nm处的吸光值称为吸光值2。
结果表明，往体系1中加入氯化钠溶液后，吸光值1为1.16 (图3c)，往体系2中加入 氯化钠溶液后，吸光值2为1.64 (图3b)。吸光值2与吸光值1有明显的差异，据此可以判 断存在突变。
实施例2
将该检测方法应用于检测人p53基因密码子245处的点突变，碱基G突变为碱基AP](参 见文献Rangel-Lopez A， Maldonado-Rodriguez R, Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005, 15(8):1-13)，具体操作步骤如下
1) 将野生型单链DNA42 pmol、等量的与野生型单链DNA序列完全互补的探针探针(与 野生型单链DNA完全互补的序列)和45 4.81 nmol/L的纳米金混匀，室温静置12min后 加入4pL lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.082，混匀后室温静置33min，得到的体 系称为体系1。
2) 将突变型单链DNA42 pmol、等量的与野生型单链DNA序列完全互补的探针探针(与 野生型单链DNA完全互补的序列)和45 7.54 nmol/L的纳米金混匀，室温静置12min后 加入4pL lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.082，混匀后室温静置33min，得到的体 系称为体系2。
3) 往步骤1所得的体系1中加入11 lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.25， 混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值1。
4)往步骤2所得的体系2中加入11 nL lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.25， 混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值2。
结果表明，往体系1中加入氯化钠溶液后，吸光值1为0.78 (图4c)，往体系2中加入 氯化钠溶液后，吸光值2为0.97 (图4b)。吸光值2与吸光值1有明显的差异，据此可以判 断存在突变。
实施例3
将该检测方法应用于检测人p53基因密码子245处的点突变，碱基G突变为碱基A^(参 见文献Rangel-Lopez A, Maldonado-Rodriguez R， Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol， 2005, 15(8):1-13)，具体操作步骤如下
1)将野生型单链DNA 35 pmol、等量的与野生型单链DNA序列完全互补的探针探针(与 、對生型单链ONA完全互补的序列)和40 2.8 nmol/L的纳米金混匀，室温静置9min后加 入4pL lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.091，混匀后室温静置35min，得到的体系 称为体系1。
.、2)将突,，.^^i)NA.35q)mok:等量的与野生型单链DNA序列完全互补的探针探针(与 "野生型单链DNA完全互朴的序列)'和40 2.8 nmol/L的纳米金混匀，室温静置9min后加 入4nLlmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.091，混匀后室温静置35min，得到的体系 称为体系2。
3) 往步骤1所得的体系1中加入6 nL lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.2，混 匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值1。
4) 往步骤2所得的体系2中加入6 lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度先0.2，混 匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值2。
结果表明，往体系1中加入氯化钠溶液后，吸光值1为0.39 (图5c)，往体系2中加入 氯化钠溶液后，吸光值2为0.58 (图5b)。吸光值2与吸光值1有明显的差异，据此可以判 断存在突变。
实施例4
将该检测方法应用于检测人p53基因密码子282处的点突变，碱基C突变为碱基T[3](参 见文献Rangel-Lopez A, Maldonado-Rodriguez R, Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005, 15(8):1-13)，具体操作步骤如下
1) 将野生型单链DNA 28 pmol、等量的与野生型单链DNA序列完全互补的探针探针(与 野生型单链DNA完全互补的序列)和42 7.4 nmol/L的纳米金混匀，室温静置16min后加 入3^iLlmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.067，混匀后室温静置29min，得到的体系 称为体系l。
2) 将突变型单链DNA28 pmol、等量的与野生型单链DNA序列完全互补的探针探针(与 野生型单链DNA完全互补的序列)和42 7.4nmol/L的纳米金混匀，室温静置16min后加 入3^L lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.067，混匀后室温静置29min，得到的体系 称为体系2。
3) 往步骤1所得的体系1中加入10 lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.236， 混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值1。
4) 往步骤2所得的体系2中加入10 lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.236， 混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值2。
结果表明，往体系1中加入氯化钠溶液后，吸光值1为1.02 (图6c)，往体系2中加入 氯化钠溶液后，吸光值2为1.57 (图6b)。吸光值2与吸光值1有明显的差异，据此可以判 浙存在突变。
实施例5
将该检测方法应用于检测人p53基因密码子282处的点突变，碱基C突变为碱基T (参 见文献Rangel-Lopez A, Maldonado-Rodriguez R, Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005， 15(8):1-13)，具体操作步骤如下
1) 将野生型单链DNA 19 pmol、等量的与野生型单链DNA序列完全互补的探针探针(与 野生型单链DNA完全互补的序列)和48 5.49 nmol/L的纳米金混匀，室温静置8min后加 入4nL lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.077，混匀后室温静置36min，得到的体系 称为体系l。
2) 将突变型单链DNA 19 pmol、等量的与野生型单链DNA序列完全互补的探针探针(与 野生型单链DNA完全互补的序列)和48 5.49 nmol/L的纳米金混匀，室温静置8min后加 入4pL lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.077，混匀后室温静置36min，得到的体系 称为体系2。
3) 往步骤1所得的体系1中加入13 lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.261， 混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520 nm处的吸光值称为吸光值1 。
4)往步骤2所得的体系2中加入13 pL lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.261， 混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值2。
结果表明，往体系1中加入氯化钠溶液后，吸光值1为0.82 (图7c)，往体系2中加入 氯化钠溶液后，吸光值2为1.21 (图7b)。吸光值2与吸光值1有明显的差异，据此可以判 断存在突变。
实施例6
将该检测方法应用于检测人p53基因密码子282处的点突变，碱基C突变为碱基T[3](参 见文献Rangel-Lopez A， Maldonado-Rodriguez R, Salcedo陽Vargas M， et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005, 15(8):1-13)，具体操作步骤如下
1) 将野生型单链DNA 10 pmol、等量的与野生型单链DNA序列完全互补的探针探针(与 野生型单链DNA完全互补的序列)和46 3.87 nmol/L的纳米金混匀，室温静置7min后加 入5pL lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.098，混匀后室温静置31min，得到的体系 称为体系1。
2) 将突变型单链DNA 10 pmol、等量的与野生型单链DNA序列完全互补的探针探针(与 野生型单链DNA完全互补的序列)和46 3.87 nmol/L的纳米金混匀，室温静置7min后加 入5nL lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.098，混匀后室温静置31min，得到的体系 称为体系2。
3) 往步骤1所得的体系1中加入14 lmol/L的氯化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.292， 混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520 nm处的吸光值称为吸光值1 。
4) 往步骤2所得的体系2中加入14 lmol/L的氧化钠溶液，氯化钠的终浓度为0.292， 混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520 nm处的吸光值称为吸光值2。
结果表明，往体系1中加入氯化钠溶液后，吸光值1为0.66 (图8c)，往体系2中加入 氯化钠溶液后，吸光值2为0.83 (图8b)。吸光值2与吸光值1有明显的差异，据此可以判 断存在突变。
权利要求
1.一种用纳米金检测DNA突变的方法，其特征在于其具体步骤如下1)将野生型单链DNA、与野生型单链DNA序列完全互补的探针和纳米金混匀，静置后加入氯化钠溶液，混匀后静置，得到的体系称为体系1；2)将突变型单链DNA、与野生型单链DNA序列完全互补的探针和纳米金混匀，静置后加入氯化钠溶液，混匀后静置，得到的体系称为体系2；3)往步骤1所得的体系1中加入氯化钠溶液，混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值1；4)往步骤2所得的体系2中加入氯化钠溶液，使氯化钠的终浓度与步骤3中氯化钠的终浓度相同，混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值2；5)当吸光值2与吸光值1有明显差异时，可以判断有突变存在。
2. 如权利要求1所述的一种用纳米金检测DNA突变的方法，其特征在于所述的纳米金 的粒径范围为5 50nm。
3. 如权利要求1所述的一种用纳米金检测DNA突变的方法，其特征在于野生型单链 DNA、与野生型单链DNA序列完全互补的探针和纳米金的加入量为野生型单链DNA :纳米 金=(10 50) pmol: (40 50) pL。
4. 如权利要求1或3所述的一种用纳米金检测DNA突变的方法，其特征在于与野生型 单链DNA序列完全互补的探针与野生型单链DNA等量。
5. 如权利要求1所述的一种用纳米金检测DNA突变的方法，其特征在于在步骤l)中， 氯化钠的终浓度为0.05~0.1 mol/L。
6. 如权利要求1所述的一种用纳米金检测DNA突变的方法，其特征在于突变型单链 DNA、与野生型单链DNA序列完全互补的探针和纳米金的加入量为突变型单链DNA :纳米 金=(10 50) pmol : (40 50) nL。
7. 如权利要求1或6所述的一种用纳米金检测DNA突变的方法，其特征在于与野生型 单链DNA序列完全互补的探针与突变型单链DNA等量。
8. 如权利要求1所述的一种用纳米金检测DNA突变的方法，其特征在于在步骤2)中， 氯化钠的终浓度为0.05~0.1 mol/L。
9. 如权利要求1所述的一种用纳米金检测DNA突变的方法，其特征在于在步骤3)中， 氯化钠的终浓度为0.2-0.3 mol/L。
全文摘要
一种用纳米金检测DNA突变的方法，涉及一种检测DNA突变的方法。提供一种用纳米金探针检测DNA突变的方法。将野生型单链DNA、与野生型单链DNA序列完全互补的探针和纳米金混匀，静置后加入氯化钠溶液后静置得体系1；将突变型单链DNA、与野生型单链DNA序列完全互补的探针和纳米金混匀，静置后加入氯化钠溶液后静置得体系2；往体系1加入氯化钠溶液，混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值1；往体系2加入氯化钠溶液，混匀后作紫外可见吸收光谱检测，所得的520nm处的吸光值称为吸光值2；当吸光值2与1有明显差异时，可判断有突变存在。DNA和纳米金无需作任何修饰，简化样品的处理。
文档编号C12Q1/68GK101344481SQ20081007160
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月18日 优先权日2008年8月18日
发明者孙莉萍, 张其清, 张召武, 张建锋, 辉 李, 霜 王 申请人:厦门大学