专利名称：：一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因诊fH式剂盒，具体地说关于一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂M離测方法和应用。
背景技术：
：胰腺癌是消化系统的恶性肿瘤，恶性程度很高，胰腺癌的发病率相对比较低，但致死率非常高，到目前为止，大多数胰腺癌患者都在确诊后一年内死亡。近年来，胰腺癌的发病率逐年上升，男女比例为l:7—2:1;40岁-70岁约占80%，胰腺癌发病在世界各地均有迅速增加，居全身恶性肿瘤的第七位。胰腺位于腹腔深部，且胰腺癌患者在早期没有明显的症状和体症，仅20%的胰腺癌患者有手术机会，术后复发率高，生存期短。国外一组100，313例胰腺癌患者的统计，5年存活率5%，中位生存时间小于20个月，国内报告8省2市14家三甲医院2340例胰腺癌患者术后5年生存期8.5%，中位生存时间为17.1月。在美国胰腺癌是肿瘤的第4位死因，国内是第8-10位死因。1989年美国有2.5万人死于胰腺癌，2005年死于胰腺癌的人数约10万，占肿瘤死亡第4位。我国每年死于胰腺癌患者达数十万人，胰腺癌的发病人数已占癌症发病率的第8位。胰腺癌的早期症状不明显，目前的影像医学检测手段显示有胰腺占位性病变时，已属晚期，生存期超过一年的很少。目前临床上的诊断手段——通过X线、B超、CT、核磁共振等能分辨2CM以下的肿瘤已经不错。目前医学影像学的2CM以下的肿块属于早期癌症这一界限科学性不够严谨，从细胞学的角度，1CM肿块约有1亿个肿瘤细胞，2CM的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞。事实上，从单克隆癌細胞到2CM以下的肿块可能是相当长的病理演变过程，可能是一年或两年，从癌变前期到癌细胞形成和生成2CM肿块要经过相当长的病理演变过程，在这个病理演变过程中，难以证实早先形成癌细胞克隆肿块是唯一的癌块，可能在最早形成克隆肿块的同时，癌细胞通过不同的途径迁移到其它部位克隆生长。这在临床上己得到证实，一旦切除肿块后，其他地方复发或其它多发的肿块先后形成或转移。因此，依照传统的影像医学和其它生化指数的诊断认定的"早期诊断"这一概念值得认真讨论，在临床上以2CM以下的肿块大小来界分早期与否，不够严谨，这是导致癌症死亡率不降的真正理由。随着分子生物学技术日益完善，功能基因组学，疾病基因组学和癌症基因组学研究的深入开展。能够更早期在基因水平上做出诊断，在仅有少数几个癌细胞克隆生长或癌变前期、早期的迁移、肿瘤干细胞的存在和繁殖时就能检出，对于胰腺癌治愈率的提高有很大的临床意义。Palladin基因取名自15世纪意大利的建筑师Palladin，这是一种细胞构架胶合蛋白，可以提供分子"胶水"来保持细胞的形态，并通过原生质膜把细胞相互连接起来，在这些细胞中Palladin在细胞分化形成特定形状时起着重要作用。美国的华盛顿大学和匹兹堡大学的研究人员在家族性胰腺癌的病患检测到Palladin基因的一个突变和过度表达，而散发性病例中亦发现Palladin基因的过度表达。进一步的研究证实，正常和癌变胰腺样品独立系(包括前述的家族成员样品)中定量分析PalladinRNA的表达，分析结果表明Palladin基因在零散的和家族遗传性的胰腺癌早期中都是过量表达。进而对Palladin基因测序，发现是这个家族成员中出现了Palladin的突变，将这个突变引入到一个人类细胞系中，证明这个突变增加了细胞迁移频率，破坏了细胞的细胞骨架。有关报道用基因芯片高通量的技术检査胰腺癌病人的4号染色体，发现4号染色体与胰腺癌密切相关，在已瞄定的243多个基因中发现唯独Palladin基因过度表达，在家族性胰腺癌的标本和散发性病例都证实Palladin基因在胰腺癌病例有一个突变和过度表达。以上的研究结果都说明突变的Palladin基因与这个家族胰腺癌发生密切相关，而且Palladin的过量表达也与许多其它胰腺癌患者有关联。Palladin基因是至今发现的与胰腺癌的致癌和致转移单一性有关的基因。目前对Palldin基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床推广应用，特别是个性化的应用在我国现阶段条件尚未见介绍。根据现有的文献资料Palladin基因的检测技术未见报道。原位杂交技术(insituhybridization)是将^T生物学与细胞化学技术结^来，以fei己的核酸M为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经a^i己的核酸单,连(即^针)，，宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即耙核皿生杂交，再以方m自显影或免疫细胞化学方、ix^H己探^a行探测，从而在细胞原位显^t寺异的DNA或RNA^。中国专利文献CN1556221公开了"IC53基因及其相关产物诊断和治疗结肠癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒"。中国专利文献CN1769485公开了"t节L^贝病原数克次氏体的原位杂交检测方法及其试剂盒，。中国专利文献CN1556410公开了"一种鱼类病毒的检测试剂皿，测方法"。中国专利文献CN1680597公开了"一种用于定量检测丙型肝炎病^(HCV)的荧光定量PCRi^剂^:"。中国专利文献CN2918435，公开了"一种检测肥胖相錢因SNP的寡核苷酸芯片及试剂盒"。但是，关于Palladin基因的原，交检测试剂^&皿测技术未见报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题是，提供一种胰腺癌症早期的原g交检测试剂皿微测方法和应用，倉,检测早期胰腺癌，或者在治疗后能及早地预测转移复发状况。为了解决战问题，本发明麟了，一种胰腺癌症早期的原條交检测试剂盒，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQIDNO:l所示，其长度为5773bp,位于4号染色体4q23"3。作为可选的技术方案，所述的杂交探针序列如SEQIDNO:1所示的RNA序列。作为可选的技术方案，戶;m的标己物选自方m性核素或非鹏t性iHB物。作为可选的技术方案，戶腿的細寸性核織自3H、35S、1251或3￥中的一种。作为可选的技术方案，戶腿糊一娜性^H己物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣概氧化酶或荧光素中的一种。作为可选的技术方案，戶脱的非娜性新己物雌自地高辛。作为可选的技术方案，还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸W[体。本发明还提供了一种Palladin基因的原g交检测方法，该方纟跑括以下步骤a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA^I虫，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。作为可选的技术方案，戶腿a步骤中形成杂交复合体的斜牛为核麟交的^驢为42'C;核酸杂交的时间为16—24小时，戶腿的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。本发明还掛共了试剂盒在制备检测胰腺癌症早期疾病药物中的应用。本发明的检测试剂盒是采用核^^交技7l^n组化免疫方法相结合，以Palladin基因为检测膽，合成探针是Palladin基因的DNA或RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的皿量。原位杂交技术的显示方法能^f共Palladin基因的半定量或定量表达禾號判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量,正常人Palladin基因不，，即不显色，Palladin基因在胰腺癌病人高表达。本发明的诊断i式剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核麟交原理是好生物学业内人士均熟知，具條作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免S&化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括仪器操作1)將待测标本駄反应槽中；2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；自动后固定；自动预杂交(42。C);自动清洗；自动杂交(42。C);自动清洗；自动与DIG抗体培养(室温)；自动清洗，显色；3).仪器自动弃去液体，4).仪器自动弃去液体，5).仪器自动弃去液体，6).仪器自动弃去液体，7).仪器自动弃去液体，8).仪器自动弃去液体，9).仪器自动弃去液体，10).取出封片镜检。本发明优点在于1、本发明麟的试剂誠有灵M高、特异性强的特点。2、本发明的检测方娥作方便、简单，能在区级以上医院普遍〈顿和推广。克月艮了目前对Palladin基因的研究都采用高通量基因芯片方法，而这些方法多用于禾辆开方面，不适应临床应用的缺陷。3、本发明的临床意义是更早期检测胰腺癌症发生，本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影j象医学检査有显著不同。本发明可以在基因水平上(癌变前期或癌细胞增殖)检测Palladin基因异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶之前，及早于其它l觌曳癌症生化指标未产生异常之前，亦未形劍中瘤之前，會扱早做到以上基因皿异常的信息采集，给临床胰&鶴症病患一个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施胰腺癌的早期诊断、早期予页防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌症恶疾。4、用Palladin基因试剂，测胰腺癌症比用其它试剂皿影像医学诊断技术检测月Hi癌症更早期、敏感性更好。本发明采用核酸原位杂交技术检测Palladin的mRNA或DNA比蛋白诊断方法更早期、敏感性更好。图1是本发明实施例中^l;突癌症病人Palladin过量泰ii图。图2是本发明实施例中正常人Palladin图。具体实施例方式下面结合图对本发明麟的一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂M^^测方法和应用的具体实施方式做详细说明。实施例1一种S熟鱸症早期的原録交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQIDNO:l所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下消化液100mJ/管l管/盒无腿明液体傲户液100^1/管l管/盒无腿明液体预杂交液1300^]/管2管/盒无fe3t明液体正义杂交液1(V]/管l管/盒无爐明液体反义杂交液l管/盒无髓明液体封闭液層0jjJ/管l管/盒无髓明液体7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>J^试剂成分说明(所有试剂购自SIGMA)1、消化液20m^ml蛋白酶K,100mg蛋白酶K，力卩DEPC-H205ml;2、保护液0.2g的glycine加入lml的lx缓冲液I;3、预杂交液lx缓冲液n7.5ml50xD3ml10mg/mlyestt-RNA750ul1lmg/mlSALMONTESTESDNA682ul0.04MEDTA3ml50%formamide15ml4、封闭液0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入lmllx缓冲液m;5、lOx缓冲液I:(PH7.1-7.4)NaCl80gNa2HP04.12H20360gKC12gKH2P042g加三蒸水至ll,并高压灭菌；6、lOx缓冲液II:(PH7.0)NaCl175.3g機,88.2gHC1几滴加三蒸水至11，并高压灭菌；7、缓冲液III:(PH7.9)Tris121.lgNaCl87.66gHC160ml左右加三蒸水至ll，并高压灭菌；8、缓冲液IV:lMTris-HCl(PH9.5):Tiis121.1g加HC13ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至11，并高压灭菌；1MNaCl:NaCl58.44加水至11，并高压灭菌；0.5MMgCl2:101.65gMgCl2.6H20加7K至11，并高压灭菌；9、固定液多聚甲醛40g加lx缓冲液I至ll,稍加救约50-60度)搅拌至溶解；10、显色剂A:NBTlg加70。/bDMF11.44ml;11、显色剂B:BCIPlg加100%DMF30ml。本发明的试剂盒可以多人伤MOT或一人份fOT。实施例2一种胰腺癌症早期的原位杂交检测方法一、标本处理1、用10ml的离心管，装4,5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗WL缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血淋巴细胞分离液^:1.5)的离心管中,2000r/min离心10min;2、吸取中间层白细胞至另一离心管中,再在此管中加入约两倍的lx缓冲液I,混匀，1500g/min离心10min;3、弃上清.沉淀加入约两倍的1x缓冲液I,混匀，1500g/min离心10min;4、弃上清，并把试管口多余的液体用纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然千燥。(有斜牛的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；5、用40ml4。/。固定瓶在鹏缸中，固定30mi^再用lx缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；6、标本可保存在-20。C，或继续做实验。二将试剂盒中试齐晒己制成f顿浓度1、将10x缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成lx缓冲液I;2、将20x缓冲液n用三蒸7jC按l:10,成2x缓冲液II;按1:100成0》缓冲液11;按1:200,成0.1x缓冲液II;3、将10x缓冲淑II用三蒸水按1:10成lx缓冲衝II;4、10x缓冲液IV用三蒸水按l:10稀释成x缓冲液IV(取W，2弁，3弁各10m1,加水至100ml既,。三、实验步骤1、取每位待M标本两张，(另外两张留作复查用)及阳'IW照标本两张(每次实验做一对阳f顿照)；2、在鹏缸里加消化液(消化液100ul加lx缓冲液199.9ml，即为^f顿浓衝20ml。37°C7jC浴预热10假。M16张玻片，37。C处理12min^再用1x缓冲液I洗5min;3、用0.2%的保护液(保护液lml加1x缓冲液199ml即为使用浓節洗lOmin,三蒸水洗5min,以Jdi程都在，feriS行。玻片自然^B喿；4、将玻片方JCA保湿盒内,加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片,盖紧保湿盒，放在42。C恒温水浴箱中3h以上；5、取出玻片，弃去盖玻片,将玻片駄玻璃缸内,用70。/。,90。/0,95。/。的6餘洗2min,自然干燥；6、将玻片方JCA保湿盒内,每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保餘放在42。C恒&R浴箱中16-24h;7、取出玻片，弃去盖玻片,将玻片駄玻璃缸内在42'C恒M7夂浴箱中用2x缓冲液n洗两次,每次15min在42"恒^7jC浴箱中用0.2x缓冲液n洗一次，每次15min在42"睦^K浴箱中用O.lx缓冲液n洗两次,每次15min;8、用lx缓冲液m洗30s,取出断,自然千燥；9、将玻片方iA保湿盒内，加0.5%1封闭液(lml封闭液加5mllx缓冲液m)10諸片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min;10、取出玻片,用lx缓冲液m洗30s,自然千燥；11、将玻片方M保湿盒内,加碱性磷酸離晰加入1.8mllx缓冲液m)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min;12、取出玻片,用lx缓冲液m洗3次，每次15min;13、lx缓冲液IV洗2min，加显色齐0(显色剂A73.3ul,显色剂B157.5ul加到30mllx缓冲液IV中，混匀),室温避光12h以上；14、用三蒸水洗5mi^自然千燥，(用甘油加10。/。的lx缓冲液I混匀)封片镜检。四、结果判断在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。阳',照标本加反义杂交液的应该80%以上染上紫色。所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。月癌症病人Palladin过量表达图见图1。正常人Palladin图见图2。地高辛+斜己的cDNA、RNA和寡核苷酸微，不但探针的具有生物素^i己优点，还克服了生物素丰射己的探针在原位杂^i程中受组织内源性生物素千优等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位,根据^的细胞数，判断目的基因的量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的Palladin基因表达量，用来确定胰腺癌是否发生，临床研究表明，Palladin基因是胰腺癌的特异性基因，Palladin基因在正常人中不誕，唯独在胰腺癌病人中表达，一旦Palladin基因表达，说明胰腺癌症已经发生，从而获得胰腺癌的诊断信息。以上所述仅是本发明的实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明原理的鹏下，还可以做出軒^JS和润饰，这些6fca和润饰也应视为本发明的{，范围。11序列表SEQUENCELISTING〈110〉芮屈生物技术(上海)有限公司〈120〉一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用<130〉/〈150〉200710171741.6〈151〉2007-1卜30<160〉1<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211>3321〈212>DNA<213>Homosapiens<400>1atgtcagggacctcctcccatgagtccttctatgactccctctcagacatgcaggaagaa60agcaagaatactgacttcttcccgggcctttctgctttcctcagccaggaagagataaac120aagagtcttgacctggcccggagagccatagccgactccgaaacagaagattttgactcg180gaaaaggagatctcgcagattttcagtacttctcctgcaagcctctgtgaacatccttcc240cataaggagaccaaattgggtgaacacgcctcgaggagacctcaggataacaggtcaaca300cctgtccagcctctggcagagaaacaaactaagagtatctcttcacctgtttcaaagagg360aaacctgccatgtcacccctgctcaccaggcccagctacatccggagcctccgaaaggct420gaaaagcgtggtgcaaaaactcccagcacaaacgtaaagcccaaaacgccacatcaaaga480aagggtggcccccagagccagctgtgtgacaaggcagctaatttaattgaggagctaaca540tccatatttaaagccgcaaagccaagaaacagaagcccaaatggggagtcctcgtcacca600gacagtgggtacctgtctcctaaaaatcagccgtcagccctgctgagtgcctcagccagc660cagagccctatggaagaccaaggggagatggaaagagaggtcaagtcccctggggccagg720cattgctaccaggacaaccaggacttggcagtgccacacaaccgcaagtctcacccacag780gaagtagcagaagggagccgagtttatctggagtgtagagtcactggaaacccc己ctcctcgagtcagatggttctgtgaagggaaagaactgcacaacactcctgatattcaaatccacccccacagcgccctccacttcccagctgcacctcgattcatccaaaagctgaggagccaa840■960tgtgagggaggggacctccataccctgatcatagcagaggcctttgaggacgacacaggt1020cgctacacctgtttggctacgaatcccagcggctcagscacaacatctgctgaggtgttc1080attgaaggtgccagttcaacag3ttctgacagtgaaagtttagctttcaaatcaagagct1140ggagctatgccacaagctcaaaagaaaacaacttctgtttccttgacaataggatcatca1200tctccaaagacaggggtgaccacagctgtgattcaaccactgtctgtccctgtgcaacag1260gttcacagtccaacttcatatctctgccgacctgatggaaccactactgcctactttcct1320cctgtttttacaaaggaactgcaaascacagccgtggcggaaggccaggtggtggttctg1380gagtgccgggtccgtggggcaccccctctgcaggtccagtggtttcggcaagggagtgaa1440atccaagactctccagatttccgaattctacagaaaaaacctagatctacagctgaacct1500gaggagatttgcaccctagttatcgctgagactttccctgaagatgcagggatctttaca1560tgttcagcaagaaatgattatggatcagcaaccagcactgcccagctggttgtcacctca1620gccaacactgaaaactgtagttacgagtcaatgggagaatccaacaatgaccacttccaa1680cactttccacctccccctccaatcttggagacaagttccttggagttggcttcaaagaaa1740ccatctgagatccggcaggtgaacaaccctgagttaggcctgagcagggcagcccttcaa1800atgcaattcaatgctgctgagagggaaacgaacggagtccatcccagccgtggagtaaat1860ggactgattaacggcaaagctaacagtaataaatctcttccaacaccagctgtcctgctt1920tcacccactaaggagccaccacctctgcttgccaaaccaaaactaggatttccaaagaag1980gccagtagaactgctagaatagcctccgatgaggaaattcaaggcacaaaggatgctgtt2040attcaagacctggaacgaaaacttcgcttcaaggaggacctcctgaacaatggccagccg2100aggttaacatacgaagaaagaatggctcgtcgactgctaggtgctgacagtgcaactgtc2160tttaatattcaggagccagaagaggaaacagctaatcaggaatacaaagtctccagctgt2220g^cagagacggtgatg卿atgaagctgagctggaaatcagtgatcacttccaccctag3gttgtsctgccctcaggccaatgsacc^actgttcaaggatctaagctgtgcgtgagaatctacac3tgttgctgctagttgctgatgatattttggaC8gg3C^CCtggtatactggtttacattttcatcagtgattcagtatggaacattacaaca^eigcca^aacaccattcaatg3tg3tgggacggctaatatcctcatgtttcaggagcgggca3Ctag3acggggtgcsgtatagctacaagaagcacaggtacccagtacggctacattgtcagccsactcgacattaagatgtgcctg已tctttgaggatctattgg3ag3gatctcggtacaggctcagaaggcctattcttcagactgcagaatgtggaaagcccctctctgatccaaccgagcaca^ccccctgcggctgg3atgaatcactcctgcctgctcgaatgaagca33ggCt3ga已3gtgg犯犯tgggaatgccagtttaaagatggatgggacctattatggctggtcaaccaaacgttctagatcctcacttctgaxtgca^ggtacgccctg3tag3gccaggg3cagaactgtgtttattgtgtcgtgtatactcacagcagggattgtgtggtctcctgtgaatggcaccgg￡L8gCag3tgctccctccaC犯3CCCtC3g鄉tcgaagC33ggg3C3gtgcaggctcctcagtgggttacagtgctcatcacgtcacgcattcagcct3ga^gctccatgggagtgccctgaccgagtccaca^3a<g8cctgtactgcggatgaatcaattctttgELg3tg"Ug3gtgctctccaaagtaccacagccgggccgcatctccccggtcttggagacgaatggsgatctg3ccaacccc3caagatgctgtgatgccggcggagcttgtgaccacctcaggagcatgcac卿tgctgggcaggctggac228023402400246025202580264027002760282028802940300030603120318032403300332权利要求1.一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于所述的杂交探针序列如SEQIDNO1所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的杂交探针序列如SEQIDNO:1所示的RNA序列。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的放射性核素选自3H、35S、1251或32P中的一种。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣t^l氧化酶或荧光素中的一种。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的非放射性标记物优选自地高辛。7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。8.—种胰腺癌症早期的原g交检测方法，其特征在于，该方法包括以下a、将权利要求1或2所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于a步骤中形成杂交复合体的条件为核酸杂交的温度为42°C;核酸杂交的时间为16—24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。10.根据权利要求1或2所述的试剂盒在制备检测胰腺癌症早期疾病药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种胰腺癌症早期的原位杂交检测试剂盒，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物、增效剂，其中所述的杂交探针序列如SEQIDNO1所示。本发明还提供了一种Palladin基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a.将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b.检测a步骤得到的杂交复合体。本发明另外还提供了试剂盒在制备检测胰腺癌症早期疾病药物中的应用。本发明优点在于本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。文档编号C12Q1/68GK101429555SQ20081018198公开日2009年5月13日申请日期2008年11月27日优先权日2007年11月30日发明者张云福,裘建英申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司