专利名称：一种应用悬浮芯片技术检测宋内志贺氏菌方法
技术领域：
本发明涉及一种分子生物学检测芯片，具体的是一种应用悬浮芯片技术对 宋内志贺氏菌进行检测。
背景技术：
悬浮芯片技术是将基因芯片技术与流式细胞仪技术结合产生的一种新技 术，是一种多重数据获取和分析平台，全名为"多功能多指标同步分析体系"
(Flexible Multiple Analyte Profiling, xMap), 也禾尔为Multi-Analyte Suspension Array,有机整合了荧光编码微球、激光技术、微流体技术、快速信号处理和数 据分析系统，即保证了信号质量，又提供高通量的新一代分子检测技术平台。 悬浮芯片与传统的基因芯片最大不同之处在于，传统的基因芯片点样在玻片或 尼龙膜上，依靠坐标定位进行寻址，而悬浮芯片将检测探针共价交联到不同的 色标微球上，根据色标微球上所带的荧光素进行区分。
悬浮芯片系统主要由三部分组成1、微球直径5.6pm左右，由聚苯乙烯 构成的，表面带有约108个羧基位点，可与寡核苷酸探针和蛋白以肽键耦联；2、 荧光素微球中标记了红色和橙色荧光素，每种分成10个浓度梯度，将微球分 成可被识别的100种微球，当微球被635nm激光激发后，能发射658nm和712nm 的荧光；3、检测仪因微球直径5.6pm，并被荧光标记，采用流式细胞仪技术原 理进行检测。
原理每一种色标微球可通过羧基，与特定的分析物质(寡核苷酸探针、 抗原、抗体等)共价结合。将标记生物探针的微球与待测物进行特异性的结合， 再和带有第三种荧光素的报告分子反应，在一个反应孔内可同时对一个样本中的100种不同目的分子进行检测。反应后，采用96孔板进行进样。检测仪自动 将反应液吸起加入蠕动泵，泵入一个微细管中，在鞘液的作用下，单排分布的 微球单个通过检测通道。检测通道中设有两个激光探头， 一个探头可发射635nm 波长的激光，可激发标记微球的两种荧光素，从而识别不同的色标微球，进行 定性检测；另一激光探头可激发报告分子的荧光素，通过测定微球所带报告分 子荧光信号的强度，可进行定量检测。因此，悬浮芯片可进行定性定量检测目 标分子。当样本中含有目的分子，目的分子与特定的微球所带的探针吸附在一 起时，两道激光所激发的荧光均可被检测到；若样本中不含目的分子，则仅能 检测到微球所带的荧光。通过数字信号处理器与计算机自动统计软件，分析两 道激光所激发荧光的波长和信号强度，从而判断待检样本中几种至数十种检测 目标物，并通过检测荧光信号强度，对检测物进行定量分析。自动加样器依次 将不同样本加入蠕动泵中，样本之间用一小段气柱分隔开，这样在连续分析过 程中不但可以区分不同样本，可还以防止样本间的污染。
与其它蛋白质和核酸检测方法相比较，悬浮芯片具独特优点
1) 应用范围广微球表面的羧基可与核酸探针和蛋白分子耦联，能对目的 核酸和蛋白分子进行定性定量研究；
2) 敏感性高以微球作为反应载体，增加了反应物接触面积；每个微球表 面带有约108个羧基位点，以共价键方式耦联寡核苷酸探针、抗体或抗 原，探针密度高，产生的信号强；使用荧光检测，放大了反应信号，敏 感性大大提高。
3) 重复性好所进行的生物反应是在液相环境中进行的，利于保持核酸、 蛋白等生物分子天然构象，克服了传统芯片空间效应的影响，也更利于 探针和被检物质的反应，提高了检测的准确性；4) 信噪比低在微细管中对单个微球进行检测，不存在本底影响检测的问
题，无需洗脱去除本底；
5) 高通量可以同时对同一样本中的多重不同目的分子进行定性定量分 析，即提高了检测信息通量，又节约了样本用量；
6) 快速高效大大提高了反应速度和检测速度。由于所进行的生物反应是 在液相环境中进行的，杂交仅需15分钟即可完成，提高了反应速度；在 35—60分钟内，可对96个不同样本分别同时进行多达100种指标的检 测；利用96孔板和自动进样系统，可连续进行nX96个样品的检测。
7) 成本低制备过程无需特殊设备，只进行羧基与氨基间的脱水成肽反应 即可，简单易行；由于是液体储存方式， 一次制备可多次使用，平均每 个指标检测成本仅需2.5 — 5.0元；
8) 易于标准化基于上述特点，使得该技术能够做到标准化，易于试剂盒 的研制和推广。目前，悬浮芯片是美国FDA唯一批准用于临床诊断(自 身免疫病检测和人类白细胞抗原分型)的生物芯片。
人类对志贺氏菌高度敏感，只需少于十个菌即可引起人的感染，因此其传 染性强，危害性大。据国内相关资料显示，志贺氏菌在我国感染性腹泻病原菌 中居首位；美国国家申报疾病监控系统及公共卫生试验信息系统数据显示，每 年因志贺氏菌引起的病例高达448,240例，死亡70例；WHO年度报告指出，在 亚非拉各国细菌性腹泻病例多达1.5-2.5亿人，死亡65万。国家质量监督检验检 疫总局2002年第25号、26号令中明确规定志贺氏菌为食品中必检项目。
志贺氏菌具四个血清型，宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、 宋内志贺氏菌，不同血清型志贺氏菌发病率具明显的地域性；在我国宋内志贺 氏菌发病率占志贺氏菌发病率的15% (马宏，2006)。目前，在志贺氏菌的成熟检测技术中，只能实现属水平检测，无法进一步获得种水平上的信息。而不同 种型志贺氏菌在最少感染剂量、致病性、抗药性等方面具较大差距，因此实现 种水平的检测将为临床治疗提供重要信息，同时也为食品生产、环境监控提供 有力技术支撑。
对宋内志贺氏菌o-抗原基因簇生物信息学分析发现，此基因簇具一段高度
特异序列，此序列位于O-抗原聚合酶基因ifc上，仅与伤寒沙门氏菌有较小的同 源性，且与其它血清型志贺氏菌，也具较大差异性(Huo-ShuH.Houng，1997)。 通过对此基因序列在分子生物学上的分析，可在分子水平上实现对宋内志贺氏 菌的检测、鉴定。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种检测宋内志贺氏菌的悬浮芯片。本发明悬浮芯 片，包括诊断微球和与此微球耦联的特异性寡聚核苷酸探针，其中寡核苷酸探 针为宋内志贺氏菌特异性基因rfc的一段序列。本发明还公开了一段寡核苷酸探 针序列，该序列为5'-NH2-(CH2)12-CGTTCAAGACGAGTGCCTAT-3'，如序列表 中序列3所示，并在5'进行NHHCH2:h2修饰。此外本发明的悬浮芯片还包括一 对特异性引物，上游引物为B-S.srfc-F:5'-GGATAGCCGAGCAGGAATA-3'(见 序列表中序列1 ，进行Biotin标记)；下游引物为S.s rfc-R:5'-CCCTAACTGAGCC GAATAAGA-3'(见序列表中序列2)。上述引物可扩增包含上述探针序列的一段 rfc基因序列。
本发明的另一目的在于提供上述悬浮芯片的制备方法，该方法包括以下步
骤
1)制备寡聚核苷酸探针；2) 用纯水稀释氨基修饰的探针；
3) 将储备的微球振荡，然后转移到棕色EP管中；
4) 离心收集微球，加入MES液进行振荡；
5) 向悬浮微球中加入上述探针，并振荡；
6) 在微球溶液中加入新配制的10mg/mlEDC，振荡；然后进行温育；
7) 再次向微球溶液中加入新配置的10mg/mlEDC，振荡，然后进行温育；
8) 向微球溶液中加0.02n/oTween-20，离心收集微球；
9) 用0.1。/。SDS重悬微球，离心收集微球；用TE悬浮微球；
10) 用血球计数板计算微球的个数，2 — 8。C,避光保存。 应用本发明悬浮芯片检测宋内志贺氏菌是通过以下方法进行的。 根据宋内志贺氏菌rfc基因设计并合成用于PCR扩增的特异性引物，如序
列表中序列1和2所示，并对其中一条引物进行Biotin修饰；按常规方法制备 待检样本基因组DNA作为模板，使用上述特异性引物进行PCR扩增，同时使 PCR产物带上Biotin修饰；将PCR产物与制备的悬浮芯片杂交，也就是与耦联 在微球上的探针进行杂交，对杂交悬浮芯片进行链霉亲和素化藻红蛋白标记， 然后通过流式细胞仪检测荧光信号。
本发明的另一目的提供一种克服PCR假阳性的方法。本发明采用的UNG 一Taq酶体系，有效的控制了PCR假阴性产生。具体方法是PCR反应体系中， 将dTTP量减半，由dUTP替代，并加入0.05U的UNG (尿嘧啶DNA糖苷酶)。 PCR产物中被掺入一定量的dUTP， UNG通过打断核酸链上dUTP上的糖苷键， 使含dUTP的核酸不能作为模板被识别。在运行PCR程序之前先37"C温育5min， 使UNG充分消化PCR产物，94'C模板变性时，UNG失活，进行正常PCR反应。
本发明的悬浮芯片可以对宋内氏志贺菌进行鉴定和检测，具有高特异性、高灵敏度、快速、低成本易于推广等特点。
图1特异性试验结果；
具体实施例方式
为进一步说明本发明在宋内志贺氏菌检测中的应用，特举以下较佳实施例 进行说明，但本发明的应用并不限于实施例。
实施例一引物的设计和合成
1) 序列获得通过对宋内志贺氏菌O-抗原基因簇序列分析，选取特异性基 因rfc作为靶序列，并从GenBank公共数据库中获得此基因序列，编号 为AF294823.1;
2) 设计引物采用Primer Premier 5.0软件设计引物，相关参数为Tm值 55.0。C一59.0。C， GC值40.0%—60.0%, PCR产物大小为100bp—500bp， 引物大小22士3bp;
3) 引物选择将软件输出的引物进行适当的手动调节，增加或减少几个碱 基，然后在GenBank进行在线Blast比对，选取特异性高的引物，并将 其中的一条进行5'末端Biotin标记。上游引物序列为B-S.s rfc-F: 5'-Biotin-GGATAGCCGAGCAGGAATA-3'， 下游引物为 S.s rfc-R: 5'-CCCTAACTGAGCCGAATAAGA-3'，扩增片段大小为392bp;
4) 引物合成上海生工合成下游引物S.srfc-R，大连TakaRa合成Biotin标 记的上游引物B- S.srfc-F。
实施例二探针的设计和合成
1) 序列获得在上述扩增片段非引物区设计探针；
2) 设计探针采用Primer Premier 5.0软件设计探针，选定HybridizationProbes命令，在Anti-sense链上设计探针，参数同实施例一；
3) 探针选择将软件输出的探针进行适当的手动调节，增加或减少几个碱 基，然后在GenBank进行在线Blast比对，选取特异性高的探针，在5' 末端进行NH2-(CH2)12修饰，选定的探针序列为S.s rfc-Probe: 5'-NH2-(CH2)12- CGTTCAAGACGAGTGCCTAT -3';
4) 探针合成大连TakaRa合成上述探针。
实施例三悬浮芯片的制备方法
1. 用纯水稀释氨基修饰的探针到lmM(lnanomole/jil);
2. 将储备的微球振荡20 sec;
3. 取200^il微球转移到棕色EP管中；
4. 收集微球，8000g，离心l-2min;
5. 弃上清，加入50|il 0.1 MMES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid, 2國(N國 吗啉代)乙磺酸)液pH4.5，振荡20sec;
6. 向悬浮微球中加入2^illmM的探针，振荡20sec;
7. 准备新鲜的10mg/mlEDC (l國ethyl画3國[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride, l-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺)，用dH20;
8. 向微球溶液中加入2.5iJ新配置的10mg/mlEDC，振荡；
9. 在室温黑暗条件下温育30min;
10. 再次准备新鲜的10mg/mlEDC，用dH20;
11. 向微球溶液中加入2.5pl新配置的10mg/mlEDC，振荡；
12. 在室温黑暗条件下温育30min;
13. 向微球溶液中加1.0mL0.02%Tween-20; 14.8000Xg离心l一2min，收集微球；15.弃上清,用1.0mL0.1。/。SDS重悬微球; 16.8000Xg离心l一2min，收集微球；
17. 用100plTE， pH=8.0，悬浮微球，
18. 用血球计数板计算微球的个数
19. 将微球2 — 8"C，避光保存备用。
实施例四悬浮芯片快速检测宋内志贺氏菌方法
1) TIANamp Bacteria DNA kit试剂盒提取待检样本基因组DNA。
2) PCR扩增目的片段，反应条件如下
表格2 PCR反应体系组份加入体积
10 x PCR Buffer (含MgCl2)2|Lll
dGTP、 dCTP、 dATP (2.5mmol/L)各1.6 pi
dTTP、 dUTP (2.5mmol/L)各0，
B- S.srfc-F (1 nmol/L)
S.srfc-R (1 )amol/LJ1 |Lll
r。？ DN A Polymerase (5 U/pl)0.1 pi
Uracil-DNA Glycosylase (lU/|xl)0.05 |xl
所提样本基因组DNA1 pi
ddH208.45 pi
Total20 pi
PCR反应程序为94°C变性3min;运行35个循环94°C 30sec,53°C 30sec, 72°C 40sec;最后，72°C延伸3min。
3)杂交杂交液组成33.3)il 1.5XTMAC (tetramethylammonium chloride, 氯化四甲铵)，5|il上述PCR产物，加入5000个与探针耦联的微球，1 XTE将体积补充到5(^1。将杂交液在95-C变性4min， 52。C杂交15min 以上。4)检测将上述杂交后的溶液全部转移到96孔滤板中，真空过滤收集微球， 用2|ig/ml S-R-PE(Streptavidin-R-phycoerythrin，链霉亲和素化藻红蛋白) 重悬微球，置52。C 10min， Luminex检测。
实施例五悬浮芯片的特异性验证
特异性试验
用本发明的悬浮芯片对不同菌株进行特异性验证，其检测范围包括以下三 类菌株-
a) 属于前述的1株宋内志贺氏菌和4株非宋内志贺氏菌；
b) 与志贺氏菌亲缘关系较近的大肠杆菌、沙门氏菌；
C)其它有关菌株。
菌株具体信息如下 表格1
针对上述菌株，按实施例四中的方法进行检测，检测结果显示宋内志贺氏
菌呈阳性结果，其它非宋内志贺氏菌均为阴性，特异性达100%。
22
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来源与编号试验编号名称
ATCC 2592224腊样芽孢杆菌
ATCC 873925甲型副伤寒沙门氏菌
国家CDC分离株26乙型副伤寒沙门氏菌
国家CDC分离株27丙型副伤寒沙门氏菌
国家CDC分离株28痢疾志贺氏菌
国家CDC分离株29痢疾志贺氏菌
ATCC 14028s30福氏志贺氏菌
国家CDC分离株31鲍氏志贺氏菌
国家CDC分离株32宋内志贺氏菌
国家CDC分离株33霍乱弧菌01
国家CDC分离株34霍乱弧菌0139
ATCC3384735嗜肺军团杆菌
ATCC1180236嗜肺军团杆菌
ATCC653837A型肉毒梭菌
CMCC2600338B型肉毒梭菌
CMCC2606939E型肉毒梭菌
CMCC3221340A型产气荚膜
CMCC3221041B型产气荚膜
CMCC3220642D型产气荚膜
CMCC4611743绿脓杆菌
CMCC4530144单增李斯特菌
CMCC4510345小肠结肠炎耶尔森氏 菌 PCR Blank
CMCC4801746名称 埃希氏大肠杆菌 埃希氏大肠杆菌 埃希氏大肠杆菌 埃希氏大肠杆菌 埃希氏大肠杆菌 埃希氏大肠杆菌
副溶血霍乱弧菌 副溶血霍乱弧菌 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 甲型溶血性链球菌 乙型溶血性链球菌
丙型溶血性链球菌 肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 产气肠杆菌
枸橼酸杆菌
来源与编号
CMCC63301 CMCC50001 CMCC50094 CMCC50017 CMCC51197
本室保 CMCC5腕 CMCC51265 CMCC51334 IEM/PLA 860084 本院八所赠 广东CDC赠 广东CDC赠
本室保 ATCC卯27
本室保 CMCC52203
菌菌菌菌菌
u>7 6
rj rj rj rj JJ
株株株保保
A 1 w室室
3 6 S本本<formula>formula see original document page 13</formula>
权利要求
1. 一种用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片，包括诊断微球和与此诊断微球耦联的寡聚核苷酸探针，其特征是该寡聚核苷酸探针是宋内志贺氏菌O-抗原聚合酶基因rfc上的一段序列。
2. 根据权利要求1所述用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片，其中寡聚核苷 酸探针如序列表中序列3所示，在其5'进行NHr(CH2)^修饰。
3. 根据权利要求1或2所述用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片，其特征是 该芯片可鉴定和检测宋内志贺氏菌。
4. 根据权利要求1或2所述用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片，其特征在 于包括一对特异性引物，引物序列如序列表中序列1和2所示，并对序列1进 行5'Biotin修饰。
5. 权利要求1或2所述用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片的制备方法，包 括如下步骤制备寡聚核苷酸探针；用纯水稀释氨基修饰的探针；将储备的微 球振荡，然后转移到棕色EP管中；离心收集微球，加入MES液进行振荡；向 悬浮微球中加入上述探针，并振荡；在微球溶液中加入新配制的EDC溶液，振 荡；然后进行温育；再次向微球溶液中加入新配置的10mg/ml EDC，振荡，然 后进行温育；向微球溶液中加0.02。/。Tween-20，离心收集微球；用0.1。/。SDS重 悬微球，离心收集微球；用TE悬浮微球；用血球计数板计算微球的个数，2—8 。C，避光保存。
6. 权利要求1或2所述用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片使用方法，包括 以下步骤a) 根据宋内志贺氏菌rfc基因设计并合成用于PCR扩增的特异性引物， 并对其中一条引物进行Biotin修饰；b) 按常规方法制备的待检样本基因组DNA，并使用步骤a)中的引物对待检样本基因组DNA进行PCR扩增，同时使PCR产物带上Biotin 修饰；c) 将步骤b)中的PCR产物与权利要求1中所述悬浮芯片杂交；d) 对步骤c)中杂交悬浮芯片进行链霉亲和素化藻红蛋白标记，并对其 检测荧光信号。
7.根据权利要求6所述的一种检测宋内志贺氏菌的方法，其特征是上述步 骤b)所建立的PCR反应体系如下表格1 PCR反应体系组份加入体积10 x PCR Buffer (含MgCl2)2 pidGTP、 dCTP、 dATP (2.5mmol/L)各1.6 jildTTP、 dUTP (2.5mmol/L)各0.8nlB-S.drfc-F (1 |imol/L)1 (ilS.drfc-R (1 )imol/L)1 |Xl7J^ DNA Polymerase (5 U/|_il)0.1 (xlUracil-DNA Glycosylase UU/p)0.05 Jul所提样本基因组DNA1 |ilddH208.45 |xlTotal20 (ilPCR反应程序为37°C温育5min; 94°C变性3min;运行35个循环94 °C 30sec, 53°C 30sec, 72°C 40sec;最后，72°C延伸3min。
8.根据权利要求4所述的一种检测宋内志贺氏菌的方法，其中杂交温度为52 °C，杂交时间为大于15min。
全文摘要
本发明涉及一种用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片及其检测方法，该悬浮芯片包括微球载体和固定在载体上的寡聚核苷酸探针，其中该寡聚核苷酸探针是从志贺氏菌O-抗原基因簇筛选的宋内志贺氏菌特异性基因rfc中的一段DNA序列。利用设计的引物将待检样品基因组DNA扩增并标记后，利用上述悬浮芯片进行杂交，根据杂交荧光强度，可判断待检样品中是否含有宋内志贺氏菌。悬浮芯片检测灵敏度高，可达到fg级基因组DNA水平，可满足临床样本和环境样本检测需要，并具特异性高、操作简单、成本低等特点，易于推广。并采用UNG-Taq酶PCR反应体系，大大降低了PCR假阳性结果。
文档编号C12Q1/68GK101440404SQ200810181200
公开日2009年5月27日 申请日期2008年11月27日 优先权日2008年11月27日
发明者刘艳华, 琳 康, 王景林, 赵金银, 姗 高 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所