专利名称：：一种应用悬浮芯片技术检测致病性志贺氏菌方法
技术领域：
：本发明属分子生物学检测领域，具体的是一种应用悬浮芯片技术对致病性志贺氏菌进行检测。技术背景悬浮芯片技术是将基因芯片技术与流式细胞仪技术结合产生的一种新技术，是一种多重数据获取和分析平台，全名为"多功能多指标同步分析体系"(FlexibleMultipleAnalyteProfiling,xMap)，也称为Multi-AnalyteSuspensionArray,有机整合了荧光编码微球、激光技术、微流体技术、快速信号处理和数据分析系统,即保证了信号质量,又提供高通量的新一代分子检测技术平台。悬浮芯片与传统的基因芯片最大不同之处在于，传统的基因芯片点样在玻片或尼龙膜上，依靠坐标定位进行寻址，而悬浮芯片将检测探针共价交联到不同的色标微球上，根据色标微球上所带的荧光素进行区分。悬浮芯片系统主要由三部分组成1、微球直径5.6iim左右，由聚苯乙烯构成的，表面带有约108个羧基位点，可与寡核苷酸探针和蛋白以肽键耦联；2、荧光素微球中标记了红色和橙色荧光素，每种分成10个浓度梯度，将微球分成可被识别的100种微球，当微球被635nm激光激发后，能发射658nm和712nm的荧光；3、检测仪因微球直径5.6um，并被荧光标记，采用流式细胞仪技术原理进行检测。原理每一种色标微球可通过羧基，与特定的分析物质(寡核苷酸探针、抗原、抗体等)共价结合。将标记生物探针的微球与待测物进行特异性的结合，再和带有第三种荧光素的报告分子反应，在一个反应孔内可同时对一个样本中的IOO种不同目的分子进行检测。反应后，采用96孔板进行进样。检测仪自动将反应液吸起加入蠕动泵，泵入一个微细管中，在鞘液的作用下，单排分布的微球单个通过检测通道。检测通道中设有两个激光探头，一个探头可发射635nm波长的激光，可激发标记微球的两种荧光素，从而识别不同的色标微球，进行定性检测；另一激光探头可激发报告分子的荧光素，通过测定微球所带报告分子荧光信号的强度，可进行定量检测。因此，悬浮芯片可进行定性定量检测目标分子。当样本中含有目的分子，目的分子与特定的微球所带的探针吸附在一起时,两道激光所激发的荧光均可被检测到;若样本中不含目的分子，则仅能检测到微球所带的荧光。通过数字信号处理器与计算机自动统计软件，分析两道激光所激发荧光的波长和信号强度，从而判断待检样本中几种至数十种检测目标物，并通过检测荧光信号强度，对检测物进行定量分析。自动加样器依次将不同样本加入蠕动泵中，样本之间用一小段气柱分隔开，这样在连续分析过程中不但可以区分不同样本，可还以防止样本间的污染。与其它蛋白质和核酸检测方法相比较，悬浮芯片具独特优点1)应用范围广微球表面的羧基可与核酸探针和蛋白分子耦联，能对目的核酸和蛋白分子进行定性定量研究；2)敏感性高以微球作为反应载体，增加了反应物接触面积；每个微球表面带有约108个羧基位点，以共价键方式耦联寡核苷酸探针、抗体或抗原，探针密度高，产生的信号强；使用荧光检测，放大了反应信号，敏感性大大提高。3)重复性好所进行的生物反应是在液相环境中进行的，利于保持核酸、蛋白等生物分子天然构象，克服了传统芯片空间效应的影响，也更利于探针和被检物质的反应，提高了检测的准确性；4)信噪比低在微细管中对单个微球进行检测，不存在本底影响检测的问题，无需洗脱去除本底；5)高通量可以同时对同一样本中的多重不同目的分子进行定性定量分析，即提高了检测信息通量，又节约了样本用量；6)快速高效大大提高了反应速度和检测速度。由于所进行的生物反应是在液相环境中进行的，杂交仅需15分钟即可完成，提高了反应速度；在35—60分钟内，可对96个不同样本分别同时进行多达100种指标的检测；利用96孔板和自动进样系统，可连续进行nX96个样品的检测。7)成本低制备过程无需特殊设备，只进行羧基与氨基间的脱水成肽反应即可，简单易行；由于是液体储存方式，一次制备可多次使用，平均每个指标检测成本仅需2.5—5.0元；8)易于标准化基于上述特点，使得该技术能够做到标准化，易于试剂盒的研制和推广。目前，悬浮芯片是美国FDA唯一批准用于临床诊断(自身免疫病检测和人类白细胞抗原分型)的生物芯片。人类对志贺氏菌高度敏感，只需少于十个菌即可引起人的感染，因此其传染性强，危害性大。志贺氏菌可通过水、食物传播，引起人类腹泻及痢疾等。据国内相关资料显示，志贺氏菌在我国感染性腹泻病原菌中居首位；WHO年度报告指出，在亚非拉各国细菌性腹泻病例多达1.5-2.5亿人，死亡65万。国家质量监督检验检疫总局2002年第25号、26号令中规定志贺氏菌为食品中必检项目。志贺氏菌中70%菌群具致病性，而志贺氏菌的主要检测方法平板培养、免疫学方法，只能对志贺氏菌进行检测，不能鉴定出是否具有致病性。有关文献报到(PhantouamathB,2003)，致病性志贺氏菌均具有侵袭相关位点基因(invasionassociatedlocus,Ial)，在分子水平上实现对Ial基因的鉴定，可有效鉴定致病性志贺氏菌，为临床、食品生产、环境健康提供参考信息。
发明内容本发明目的旨在提供一种检测致病性志贺氏菌的悬浮芯片。本发明的悬浮芯片包括诊断微球和与此微球耦联的特异性寡聚核苷酸探针，其中该寡核苷酸探针序列为侵袭相关位点基因(invasionassociatedlocus,Ial)的一段序列。本发明还公开了一段寡核苷酸探针序列，该序列为5'-NH2-(CH2)12-AATGTCCATCAAACCCCACTC-3'，如序列表3所示，并在5'进行NH2-(CH2),2修饰。此发明的悬浮芯片还包括一对特异性的引物，其上游引物为B-Ial-F:5'-Biotin-CTGGATGGTATGGTGAGGTTT-3'(见序列表l，进行5'Biotin标记)；下游引物为IpaH-R:5'-AGGAGGCCAACAATTATTTCC-3'(见序列表2)。上述引物可扩增包含上述探针序列的一段Ial基因的序列。应用本发明悬浮芯片检测致病性志贺氏菌是通过以下方法进行的。根据致病性志贺氏菌Ial基因设计并合成用于PCR扩增的特异性引物，如序列表中序列1和2所示，并对其中一条引物进行Biotin修饰；按常规方法制备待检样本基因组DNA作为模板，使用上述特异性引物进行PCR扩增，同时使PCR产物带上Biotin修饰；将PCR产物与制备的悬浮芯片杂交，也就是与耦联在微球上的探针进行杂交，对杂交悬浮芯片进行链霉亲和素化藻红蛋白标记，然后通过流式细胞仪检测荧光信号。本发明的另一目的在于提出一种制备上述悬浮芯片的方法。本发明所提供的制备悬浮芯片的方法，具体包括以下步骤1)制备寡聚核苷酸探针；2)用纯水稀释氨基修饰的探针；3)将储备的微球振荡，然后转移到棕色EP管中；4)离心收集微球，加入MES液进行振荡；5)向悬浮微球中加入上述探针，并振荡；6)在微球溶液中加入新配制的10mg/mlEDC，振荡；然后进行温育；7)再次向微球溶液中加入新配置的10mg/mlEDC，振荡，然后进行温育；8)向微球溶液中加0.02。/。Tween-20，离心收集微球；9)用0."/oSDS重悬微球，离心收集微球；用TE悬浮微球；10)用血球计数板计算微球的个数，2—8。C，避光保存。本发明的另一目的提供一种克服PCR假阳性的方法。本发明采用的UNG一Taq酶体系，有效的控制了PCR假阴性产生。具体方法是PCR反应体系中，将dTTP量减半，由dUTP替代，并加入0.05U的UNG(尿嘧啶DNA糖苷酶)。PCR产物中被掺入一定量的dUTP,UNG通过打断核酸链上dUTP上的糖苷键，使含dUTP的核酸不能作为模板被识别。在运行PCR程序之前先37'C温育5min，使UNG充分消化PCR产物，94"C模板变性时，UNG失活，进行正常PCR反应。图1特异性试验结果；图2灵敏度试验结果；具体实施例方式为进一步说明本发明在致病性志贺氏菌检测中的应用，特举以下较佳实施例进行说明，但本发明的应用并不限于实施例。实施例一引物的设计和合成1)序列获得通过对致病性志贺氏菌进行全基因组分析，选取其特异性基因Ial作为靶序列，并从GenBank公共数据库中获得此基因序列，编号为AY206439;2)设计引物采用PrimerPremier5.0软件设计引物，相关参数为Tm值55.0°C—59.0°C，GC值40.0%—60.0%，PCR产物大小为lOObp—500bp，引物大小22±3bp;3)引物选择将软件输出的引物进行适当的手动调节，增加或减少几个碱基，然后在GenBank进行在线Blast比对，选取特异性高的引物，并将其中的一条进行5'末端Biotin标记。上游引物序列为B-Ial-F:5'誦Biotin-CTGGATGGTATGGTGAGGTTT-3'，下游引物为IpaH國R:5'-AGGAGGCCAACAATTATTTCC-3'，扩增片段大小为320bp;4)引物合成上海生工合成下游引物Ial-R，大连TakaRa合成Biotin标记的上游引物B-Ial-F。实施例二探针的设计和合成1)序列获得在上述扩增片段非引物区设计探针；2)设计探针采用PrimerPremier5.0软件设计探针，选定HybridizationProbes命令，在Anti-sense链上设计探针，参数同实施例一；3)探针选择将软件输出的探针进行适当的手动调节，增加或减少几个碱基，然后在GenBank进行在线Blast比对，选取特异性高的探针，在5'末端进行NH2-(CH2)12修饰，选定的探针序列为Ial-Probe:5'-NHr(CH2)12-AATGTCCATCAAACCCCACTC-3，；4)探针合成大连TakaRa合成上述探针。实施例三悬浮芯片的制备方法一、材料二、方法结果1.用纯水稀释氨基修饰的探针到lmM(lnanomole/Vl);2.将储备的微球振荡20sec;3.取20(^1微球转移到棕色EP管中；4.收集微球，8000g,离心l-2min;5.弃上清，加入50^10.1MMES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonicacid，2-(N-吗啉代)乙磺酸)液pH4.5，振荡20sec;6.向悬浮微球中加入2pllmM的探针，振荡20sec;7.准备新鲜的10mg/mlEDC(l-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride,l-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺)，用dH20;8.向微球溶液中加入2.5!al新配置的10mg/mlEDC,振荡；9.在室温黑暗条件下温育30min;10.再次准备新鲜的10mg/mlEDC，用dH20;11.向微球溶液中加入2.5^1新配置的10mg/mlEDC，振荡；12.在室温黑暗条件下温育30min;13.向微球溶液中加1.0mL0.02%Tween-20;14.8000Xg离心1—2min，收集微球；15.弃上清，用1.0mL0.1。/。SDS重悬微球；16.8000Xg离心1—2min，收集微球；17.用100plTE，pH=8.0，悬浮微球，18.用血球计数板计算微球的个数19.将微球2—8℃,避光保存备用。实施例四悬浮芯片快速检测致病性志贺氏菌1)TIANampBacteriaDNAkit试剂盒提取待检样本基因组DNA。2)PCR扩增目的片段，反应条件如下表格1PCR反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>PCR反应程序为94℃变性3min;运行35个循环94℃30sec,53℃30sec:72℃40sec;最后，72℃延伸3min。3)杂交杂交液组成33.3ul1.5XTMAC(tetramethylammoniumchloride，氯化四甲铵)，5ul上述PCR产物，加入5000个与探针耦联的微球，1XTE将体积补充到50ul。将杂交液在95℃变性4min，52℃杂交15min以上。4)检测将上述杂交后的溶液全部转移到96孔滤板中，真空过滤收集微球，用2pg/mlS-R-PE(Streptavidin-R-phycoerythrin，链霉亲和素化藻红蛋白)重悬微球，置52℃:10min，Luminex检测。实施例五悬浮芯片的特异性鉴定和灵敏度验证特异性试验用本发明的悬浮芯片对不同菌株进行特异性验证，其检测范围包括以下三类菌株a)属于前述的4株致病性志贺氏菌和一株非致病性志贺氏菌；b)与志贺氏菌亲缘关系较近的大肠杆菌、沙门氏菌；C)其它有关菌株。菌株具体信息如下_表格2_试验编号il来源与编号试验编号来源与编号^_枸橼酸杆菌_CMCC48017_^_PCRBlank针对上述菌株，按实施例四中的方法进行检测，检测结果显示5株志贺氏菌4株呈阳性结果，可有效鉴定致病性志贺氏菌；非志贺氏菌均呈阴性结果，特异性达100%。灵敏度试验按实施例四中的方法进行灵敏度试验，以痢疾志贺CMCC51197研究对象，将提取的模板进行定量，所提模板的量为11.8ng/ml，依次进行IO倍稀释，1213141516171819202122埃希氏大肠杆菌埃希氏大肠杆菌埃希氏大肠杆菌埃希氏大肠杆菌埃希氏大肠杆菌埃希氏大肠杆菌副溶血霍乱弧菌副溶血霍乱弧菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌甲型溶血性链球菌乙型溶血性链球菌丙型溶血性链球菌肺炎克雷伯氏菌阴沟肠杆菌产气肠杆菌ATCC25922ATCC8739国家CDC分离株国家CDC分离株国家CDC分离株国家CDC分离株ATCC濯8s国家CDC分离株国家CDC分离株国家CDC分离株国家CDC分离株ATCC33847ATCC11802ATCC6538CMCC26003CMCC26069CMCC32213CMCC32210CMCC32206CMCC46117CMCC45301CMCC4510324腊样芽孢杆菌CMCC6330125甲型副伤寒沙门氏菌CMCC5000126乙型副伤寒沙门氏菌CMCC5009427丙型副伤寒沙门氏菌CMCC5001728痢疾志贺氏菌CMCC5119729痢疾志贺氏菌本室保30福氏志贺氏菌CMCC5106231鲍氏志贺氏菌CMCC5126532宋内志贺氏菌CMCC5133433霍乱弧菌Ol86008434霍乱弧菌0139赠35嗜肺军团杆菌广东CDC赠36嗜肺军团杆菌广东CDC赠37A型肉毒梭菌62A株38B型肉毒梭菌621株39E型肉毒梭菌619株40A型产气荚膜本室保41B型产气荚膜本室保42D型产气荚膜本室保43绿脓杆菌ATCC卯2744单增李斯特菌本室保45小肠结肠炎耶尔森氏CMCC52203菌灵敏度试验中加入的模板量分别为L18fg、11.8fg、118fg、U8pg、11.8pg、118pg,以纯水做阴性对照。结果显示，灵敏度达1.18fg(相当于2—3个细菌数)，可满足临床样本及环境样本检测需要。序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所<120>—种应用悬浮芯片技术检测致病性志贺氏菌方法<140><141><160>3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1CTGGATGGTATGGTGAGGTTT21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2AGGAGGCCAACAATTATTTCC21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3AATGTCCATCAAACCCCACTC2权利要求1.一种用于致病性志贺氏菌检测的悬浮芯片，包括诊断微球和固定在该诊断微球上的寡聚核苷酸探针，其特征是该寡聚核苷酸探针是致病性志贺氏菌侵袭相关位点基因(invasionassociatedlocus，Ial)上的一段序列。2.根据权利要求1所述用于致病性志贺氏菌检测的悬浮芯片，其中寡聚核苷酸探针序列如序列表中序列3所示，在其5'进行NH2-(CH2;h2修饰3.根据权利要求1或2所述用于致病性志贺氏菌检测的悬浮芯片，该芯片可鉴定和检测致病性志贺氏菌。4.根据权利要求1或2所述志贺氏菌检测的悬浮芯片，其特征在于包括一对特异性引物，引物序列如序列表中序列1和2所示，并对序列1进行5'Biotin修饰。5.权利要求1或2所述用于志贺氏菌检测的悬浮芯片的制备方法，包括如下步骤制备寡聚核苷酸探针；用纯水稀释氨基修饰的探针；将储备的微球振荡，然后转移到棕色EP管中；离心收集微球，加入MES液进行振荡；向悬浮微球中加入上述探针，并振荡；在微球溶液中加入新配制的EDC溶液，振荡；然后进行温育；再次向微球溶液中加入新配置的10mg/mlEDC，振荡，然后进行温育；向微球溶液中加0.02n/。Tween-20，离心收集微球；用0.P/。SDS重悬微球，离心收集微球；用TE悬浮微球；用血球计数板计算微球的个数，2—8'C，避光保存。6.权利要求1或2所述用于致病性志贺氏菌检测的悬浮芯片使用方法，包括以下步骤a)根据致病性志贺氏菌Ial基因设计并合成用于PCR扩增的特异性引物，并对其中一条引物进行Biotin修饰；b)按常规方法制备的待检样本基因组DNA，并使用步骤a)中的引物对待检样本基因组DNA进行PCR扩增，同时使PCR产物带上Biotin修饰；c)将步骤b)中的PCR产物与权利要求1中所述悬浮芯片杂交；d)对步骤c)中杂交悬浮芯片进行链霉亲和素化藻红蛋白标记，并对其检测荧光信号。7.根据权利要求6所述的一种检测致病性志贺氏菌的方法，其特征是上述步骤b)所建立的PCR反应体系如下PCR反应体系组份加入体积10xPCRBuffer(含MgCl2)2pldGTP、dCTP、dATP(2.5mmo1)各1.6^dTTP、dUTP(2.5mmo1)各O単B-Ial-F(1|xmol/L)1|LllIal誦R(1pmol/L)1pira《DNAPolymerase(5U/|til)0.1|LllUracil國DNAGlycosylase(1U/|li1)0.05|il所提样本基因组DNA1piddH208,45julTotal20(ilPCR反应程序为37°C温育5min;94°C变性3min;运行35个循环94°C30sec，53。C30sec，72°C40sec;最后，72°C延伸3min。8.根据权利要求6所述使用方法，其中杂交温度为52°C，杂交时间为大于15min。全文摘要本发明涉及一种用于致病性志贺氏菌检测的悬浮芯片及其检测方法，该悬浮芯片包括微球载体和固定在载体上的寡聚核苷酸探针，其中该寡聚核苷酸探针是从致病性志贺氏菌筛选的特异性基因侵袭相关位点(invasionassociatedlocus，Ial)基因中的一段DNA序列。利用设计的引物将待检样品基因组DNA扩增并标记后，利用上述悬浮芯片进行杂交，根据杂交荧光强度，可判断待检样品中是否含有致病性志贺氏菌。悬浮芯片检测灵敏度高，可达到fg级基因组DNA水平，可满足临床样本和环境样本检测需要，并具特异性高、操作简单、成本低等特点，易于推广。并采用UNG-Taq酶PCR反应体系，大大降低了PCR假阳性结果。文档编号C12Q1/04GK101403000SQ20081018050公开日2009年4月8日申请日期2008年11月27日优先权日2008年11月27日发明者刘艳华,琳康,王景林,赵金银,姗高申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所