专利名称：：心肌梗塞早期诊断液相芯片及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及医学体外诊断技术，具体的是涉及急性心肌梗塞早期诊断的液相芯片及其制备方法。
背景技术：
：心血管疾病已发展成为我国人民的主要死因之一，其中病死率最高的是急性心肌梗塞(AcuteMyocardialInfarction,AMI)。急性心肌梗塞发生时，由于冠状动脉急性梗塞，引起持久而严重的心肌急性缺血，而使部分心肌发生坏死，是冠心病的一个很严重类型，当前病死率可达10%15%。即使急性期存活者，由于心肌坏死后，排血功能受损，其远期预后仍受到严重影响。急性心肌梗塞三大严重并发症(如恶性心律失常、心衰及心源性休克)的发生率、严重程度和预后均取决于梗塞面积的大小。急性心肌梗塞的初期，若能尽早发现并给予及时处理，可以挽救更多的濒死心肌，其预后可得到改观。急性心肌梗塞的溶栓治疗也要求对患者做出早期的诊断。因为血管闭塞的时间愈长，所能挽救的心肌就愈少，一般主张在发病46小时内进行，时间愈早，冠状动脉再通率越高。一般来说，只有在AMI发病6小时内，经过明确的诊断和适宜的治疗，病变的心肌细胞才有可能出现可逆性转变。WHO建议的AMI诊断标准有三条，即临床症状、心电图(ECG)异常和血清酶的异常。然而，大量的临床实践发现，约有25%的旭1病人发病早期没有典型的临床症状；约50%左右的AMI病人缺乏心电图的特异改变。若单独依靠心电图改变和临床症状，AMI的诊断符合率仅为75%。在这种情况下，心肌损伤生化标志物的检测在诊断AMI时尤为重要。研制高灵敏度、高特异性的早期诊断试剂，是目前提高急性心肌梗死诊断率与提高治疗效果、降低病死率的迫切需要。CK-MB曾作为发病24小时内诊断的金标准。但由于CK-MB特异性稍差，近年来又出现了许多新的检测指标。这些检测指标在AMI的早期诊断、病情监测、预后判断及减少并发症方面起了重要作用。本发明根据大量的文献资料确定了肌酸激酶同工酶(CK-MB)，肌红蛋白(Myoglobin,Mb)，心肌肌钙蛋白I(cTnl)，糖原磷酸化酵同工酶BB(GPBB)，心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)这五种在急性心肌梗塞不同病程中表达，且诊断灵敏度和特异性各有优势的心肌损伤标志物，利用液相芯片平台进行这五种指标的同步并行检测。(1)CK-MB是临床用于诊断急性心肌梗塞的最常用的指标，曾作为发病24小时内诊断的金标准。CK-MB主要存在于心肌细胞的外浆层，一直被认为是心肌酶谱中最特异的酶。CK-MB在起病4小时内增高，16-24小时内达高峰，3-4天恢复正常。但由于CK-MB并非心肌专有，诊断特异性差；同时，该蛋白在血中出现较晚，因此早期诊断灵敏度不高。此外CK-MB存留时间较短，也给AMI早期诊断带来了一定困难。有报道显示，CK-MB诊断AMI的特异性为76.25%，灵敏度为50.25%(马强，李艳梅等，2006)。(2)肌红蛋白(Mb)肌红蛋白是存在于骨骼肌和心肌细胞中的一种色素蛋白，由于分子量小，故能在轻度损伤时迅速自缺血损伤部位释放进入血液循环。Mb是心肌受损的敏感指标，在心肌梗塞发作1.5小时内血中肌红蛋白浓度明显增高，比CK-MB至少提前3小时出现，发病后4-8小时达到高峰，12-24小时可恢复正常。在发病后l一3小时内检测肌红蛋白与健康组比较已有显著差异。因此，血中肌红蛋白浓度测定，可作为AMI剔除指标，早期诊断价值高。但是Mb特异性不强，肌肉损伤和肾脏疾患时也会升高。同时，Mb存留时间短，仍有不足之处，故不能单独使用Mb的绝对值作为诊断AMI的标志。(3)心肌肌钙蛋白I肌钙蛋白是心肌收缩的调节蛋白，存在于心肌收缩蛋白的细肌丝上，由3个亚单位组成(TnT、Tnl、TnC)。临床上对前二者的研究比较深入。cTnT，cTnl是较特异的受损指标。正常情况下，cTnT和cTnl不能通过完整的心肌细胞膜释放入血，当心肌细胞受损时，通过破损的细胞膜入血。许多资料表明cTnl在AMI早期诊断上的价值与cTnT相同，但特异性高于cTnT。cTnl与骨骼肌无交叉反应，是目前发现在血中存留时间最长的指标，对AMI诊断病情监测以及不稳定型心绞痛病人的预后监测起着重要的作用。cTnl最早可在症状发作后l小时内在血中检出，3-4小时时其敏感性可达50%。其在血中持续时间较长，持续达7—14天。有报道认为其诊断AMI的特异性高达96.7%。韩瑞平等报道，AMI发病3小时，cTnl阳性率为52X，而CK-MB在48小时才逐渐升高。王敏等报道在AMI发病2.5小时，cTnl即升高，而CK-MB在8小时后方见升高。1997年，张济南等对61例扁I患者中的未溶栓组cTnl和CK-MB动态测定其变化发现AMI病人发病后36小时，血清cTnl上升，高峰在1824小时，上升时间及高峰出现与CK-MB相似，胸痛后第五天仍很高，第七天恢复到参考值范围。由此可见，cTnl诊断AMI的敏感性和时间与CK-MB接近。但CK-MB在胸痛后3天迅速降至正常，即cTnl在到达高峰后曲线下降不如CB-MB那样陡直。有些病人在梗塞后10天cTnl仍增高，这就为AMI4872小时后才入院的病人在诊断上提供了有力的依据。同时，cTnl与骨骼肌无交叉反应，因此，特异性较CK-MB更强。(4)糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)糖原磷酸化酶有3种同工酶脑型BB，骨骼肌型薩，肝型LL。GPBB除存在于脑组织外，也存在于心肌细胞中，是心肌细胞糖原分解的关键酶，是心肌细胞对缺血、缺氧最为敏感的物质成分。当AMI发作的早期，由于心肌细胞对缺血、缺氧的高度敏感性，细胞内ATP减少与ADP和无机磷酸盐增多，启动加速糖原分解，同时由于细胞膜通透性的改变，GPBB弥散于细胞外液，进入血液中，在胸痛发作4小时内明显升高(MairJ，1998;马义丽，2003)。GPBB是一种很有前景的诊断指标，其诊断的特异性与敏感性均超过80%，已引起了国内外心血管专家的广泛关注。GPBB在4小时内的阳性检出率高于75%，而CK-MB仅50X(王观宇，2006;高卫红，2006;王滔，2006)。Rabitzsch等，对116例健康人，14例稳定性心绞痛病人，107例非创伤性胸痛(45例AMI，49例不稳定性心绞痛，13例其他疾病)病人，测定血清中CK、CK-MB、MB、cTnT和GPBB。结果表明，116例正常健康人GPBB小于7ng/ml。胸痛开始后2_4小时血浆中GPBB浓度开始升高，8小时后达到峰值，40小时后恢复正常。AMI时所有指标均升高，但以GPBB升高最明显。此外，在伴有ST-T变化的不稳定性心绞痛病人，GPBB升高，其他指标正常，而无ST-T变化者，全部指标正常。说明GPBB可预示小灶性心梗的发生。(5)心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是长链脂肪酸的载体，具有调节脂肪酸代谢的作用。H-FABP大量存在与心肌组织中，是可溶性蛋白质，分子量小，是近年才应用的心肌损伤的早期指标。H-FABP含量在骨骼肌中比心肌中低10倍，在肾脏、肝脏和小肠中含量也很低。当心肌受损时，H-FABP从心肌细胞释放，迅速进入血循环，它不仅能迅速发现心肌损伤的状况，反映心肌梗死的量，并可推测心肌梗死的范围。许多研究证实，早期诊断層I时，H-FABP比CK-MB、Mb具有优越的时效性和敏感性。诊断早期AMI的总敏感性，H-FABP为78X，CK-MB为57%，Mb为53%(GlatzJF，1998);诊断AMI超急性期，H-FABP的敏感性为93.1%,特异性为64.3%;H-FABP诊断AMI的总敏感性，3小时内为64.29%，6小时内为84.38%(TanakaT，SohmiyaK，"s7，2006;ChenL，GuoX，"s入2004)。同时，H-FABP能检测出CK-MB毫无改变时的微小心肌损害，并且能早期监测第二次AMI(GlatzJF，1998)。由于各种心肌标志物在AMI的病程中有不同的表达，同时各种标志物的诊断灵敏度和特异性的差异使得各个指标在判断AMI中的价值各异。若能同时检测，诊断AMI的灵敏度、特异度及准确度将会大大提高。传统的心肌标志物检测方法主要有放射免疫法，酶联免疫法及电化学发光免疫法等。然而这些方法每次测试只能获得一种标志物的浓度。同时，传统的免疫检测方法受灵敏度限制，因此对于一些低浓度的标志物存在检测结果不准确等缺陷。
发明内容本发明的目的是针对目前急性心肌梗塞检测的方法敏感性和特异性不高以及一次反应只能检测一种心肌标志物的缺陷，提供一种同步检测多种心肌损伤标志物的心肌梗塞早期诊断的液相芯片。实现上述目的的技术方案如下一种心肌梗塞早期诊断的液相芯片，包括有1)包被微球含有分别包被了CK-MB捕获抗体的微球，包被了Mb捕获抗体的微球，包被了cTnl捕获抗体的微球，包被了GPBB捕获抗体的微球，和包被了H-FABP捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；2)生物素标记检测抗体含有分别用生物素标记的CK-MB、Mb、cTnl、GPBB及H-FABP的检测抗体；和3)链亲和素藻红蛋白。优选为，每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为110-140个4U，更优选为120个4d;每种生物素标记检测抗体的使用浓度为1-3ug/ml，更优选为2ug/ml。液相芯片技术也叫流式荧光技术，该技术由一种微球作为反应载体，微球用聚苯乙烯材料制成，直径5.6um,表面有活性羧基可供化学偶连用，抗原、抗体等生物大分子可通过氨基与微球表面的羧基通过化学反应共价结合(即包被过程)。在微球制造过程中加入红外和远红外两种荧光染料，根据两种染料混合比例的不同将微球进行编码，可区分出上百种不同编码的微球。使用时，先将CK-MB、Mb、cTnl、GPBB及H-FABP的捕获抗体分别包被于不同颜色编码的微球上，同时分别用生物素标记CK-MB、Mb、cTnl、GPBB及H-FABP的检测抗体。将包被好的五种微球混合，悬浮于液相，再加入标本，在悬液中微球上标记的捕获抗体与标本中相应的检测物的某一个表位异性地结合，之后加入生物素标记的检测抗体与标本中相应检测物的另一表位特异性结合，反应完全后加入荧光物质——藻红蛋白标记的链亲和素，由于链亲和素藻红蛋白(SA-PE)可以与生物素高度特异性结合，因此反应体系中最后形成"微球-捕获抗体+待检测物+生物素标记的检测抗体+SA-PE"的五种复合物，以微球为载体，通过Luminex系列液相芯片分析仪器检测，读取微球的色彩编号及SA-PE的荧光值。微球色彩编号可辨别检测项目，SA-PE荧光值与各检测物浓度呈正相关，通过测定CK-MB、Mb、cTnl、GPBB及H-FABP标准品在不同浓度下的荧光值，可以获得各个检测指标标准品浓度-荧光值标准曲线以及标准曲线方程。将待测血清样本检测所得荧光值代入标准曲线方程即可分别求得待测样本中的CK-MB、Mb、cTnl、GPBB及H-FABP的量。由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。本发明另一需要解决的技术问题是提供上述心肌梗塞早期诊断液相芯片的制备方法。一种制备心肌梗塞早期诊断液相芯片的方法，主要包括以下步骤(1)相应的捕获抗体包被微球-将50nL微球活化后，S8000g，离心；-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280pL50mM的MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid)的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s，后将微球于^8000g，离心l-2min;重复该步骤；-吸弃上清，将微球重悬于100|xL50mMpH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2吗抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550pL;-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr;-偶联了抗体后的微球以28000g的速度，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于500nLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声振荡约20s;-室温避光振荡30min;再于^8000g，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s,超声约20s;微球28000g，离心l-2min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于500-100(HiLPBS-TBN溶液中；-每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8'C避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为120个4il;(2)每种检测抗体的生物素标记-依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积；-用DMSO(Dimethylsulfoxide)溶解，配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；-按摩尔比l:IOO于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液；-加入体积为目标体积的pH8.9的1/10的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS补至目标体积；-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25'C恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为800rpm-腦0rpm;-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin;-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合。所述活化微球的步骤如下-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；-取50pL微球离心l-2min;-去掉上清夜，将微球重悬于lOOpL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，28000g离心l一2min;-吸弃上清，加入80pL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s;-加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-加入10nL50mg/mLEDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀。本发明方法结合液相芯片平台高通量多指标并行检测的特性与双抗体夹心法高灵敏度的特性，同步检测5种心肌损伤标志物，能提高急性心肌梗塞早期诊断的准确率，同时为急性心肌梗塞的病情监测及预后判断提供依据。本发明所公开的多项心肌损伤标志物并行检测液相芯片可一次反应同时完成多种心肌损伤标志物的定量检测，从而达到对急性心肌梗塞的早期准确诊断。本发明所提供的多项心肌损伤标志物并行检测液相芯片还具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点。另外，本发明的制备方法简单易行，稳定性好，其技术方案中的各种工艺参数如微球和抗体的量、反应过程等均是在大量试验基础上得出的，为制备过程最佳的参数值。图1是检测CK-MB的标准曲线示意图；图2是检测Mb的标准曲线示意图；图3是检测cTnl的标准曲线示意图；图4是检测GPBB的标准曲线示意图；图5是检测H-FABP的标准曲线示意图。具体实施方式实施例1心肌梗塞早期诊断液相芯片的制备及抗原的检测本发明所述的捕获抗体为分别能对应与CK-MB、Mb、cTnl、GPBB及H-FABP特异性结合的单克隆抗体；所述的检测抗体为分别能与CK-MB、Mb、cTnl、GPBB及H-FABP特异性结合的单克隆抗体或多克隆抗体。本实施例所用的"CK-MB、Mb、cTnI、GPBB及H-FABpw的捕获抗体与检测抗体购自abeam公司。本实施例中，所述各种溶液的配方如下1.50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):试剂来源终浓度每250ml的用量MES(2[N德rpholino]ethanesulfonicacid)SigmaM-29330.05M2.44g5MNaOHFisherSS256-5005滴2.PBS配方试剂目录号终浓度每1L的用量PBSSigma-3813138mMNaCl2.7mMKC11包3.PBS-TBN配方(即PBS中含O.1%BSA，0.02%Tween-20，0.05%Na3N'pH7.4)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>1.心肌梗塞早期诊断液相芯片试剂盒，包括有1)5-plex包被微球含有分别包被了CK-MB捕获抗体的20号微球，包被了Mb捕获抗体的34号微球的偶联体，包被了cTnl捕获抗体的38号微球，包被了GPBB捕获抗体的51号微球，包被了H-FABP捕获抗体的53号微球。2)5-plex生物素标记检测抗体含有分别用生物素标记的CK-MB、Mb、cTnI、GPBB及H-FABP的检测抗体；3)链亲和素藻红蛋白(SA-PE，10ug/ml);还按照现有技术配套有4)分析缓冲液；5)5-plex标准品；6)质控液I;7)质控液II;8)血清基质液；9)封口膜；10)滤板。2.制备上述液相芯片试剂盒，包括有如下步骤(1)按上述试剂盒的组成，每种捕获抗体包被相应的微球，制备方法相同--分别选取20号、34号、38号、51号、53号微球(美国Luminex公司)，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球，大约20s;-各取50pL微球于1.5ml的离心管中，8,000g以上速度离心2min;-去掉上清夜，将微球重悬于100pL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，8000g(或以上)速度离心2min;-吸弃上清，加入80pL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s;-加入10ML50mg/mLSulfo-NHS,用涡漩振荡器轻轻地混匀；-加入10nL50mg/mLEDC,用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温避光静置20min，每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀；-活化后的微球，28000g，离心2min;-吸弃上清，将微球重悬于250nL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;微球^8000g，离心l-2min;重复该歩骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于100nL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;-往悬浮的微球中加入l吗抗体，用50mM的MES(pH5.0)溶液将总体积补至500nL;-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡2hr;-偶联抗体后的微球以28000g的速度，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于50(^LPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;-室温避光振荡30min;陽微球28000g,离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;微球28000g，离心l-2min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于60(HiLPBS-TBN溶液中；-包被好的微球通过luminex仪器计数；-包被好的微球置于2-8'C避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择等比例混合。(2)按上述试剂盒的组成，每种检测抗体的生物素标记-依据蛋白浓度计算反应体系；-依据蛋白浓度计算抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积(V);-配置NHS-Biotin反应液(用DMSO溶解，使其浓度为10mg/ml);-按摩尔比l:IOO于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin(10mg/ml)反应液；-加入1/10目标体积的NaHC03(pH8.9)溶液；-加入PBS(pH7.4)补至目标体积；-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25。C恒温箱中避光孵育4h，转速为900rpm;-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin;-测定蛋白浓度。3.用于检测，包括如下步骤1)使用前先取出所有试剂，放置平衡至室温。2)标准品的稀释每个标准品设6个稀释度，然后等比例混合，使各自得终浓度为所需的浓度。各管稀释方法及理论浓度(同下表中的预期浓度)-注意每个浓度标准品稀释完后均必须用涡旋混合仪彻底混匀后才可用于下一浓度的稀释。混匀过程避免产生泡沫。3)设置96孔板布局，确定96孔板上标准品、质控品、待测样品及空白孔的位置。考虑到仪器读数的顺序是按照从第1列到第12列、从第A行到第H行的顺序纵向读数，在设置96孔板布局时应遵循从第1列到第12列、从第A行到第H行的顺序排列。4)按照设置好的96孔板布局，每孔加25^1分析缓冲液，再分别加入25ul标准品、质控品到各自孔中，空白孔加25ul分析缓冲液。5)分别取出上述制备的针对五种心肌标志物检测的捕获抗体偶联微球，用涡旋混合仪混匀30钞，超声处理30秒，按等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联的微球浓度均为120个/nl。往每孔中加入的五种捕获抗体偶联微球的混合悬液25^1。包被微球应在临用前混匀，且混匀后应立即使用，否则放置过久微球会再沉淀。6)用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，孵育60分钟。7)孵育完成后每孔加入25ul上述制备的生物素标记的检测抗体的混合液(其中所述五种生物素标记的检测抗体事先按等比例混合，使每种检测抗体最终浓度达到2ug/ml，摇匀)，用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，再孵育60分钟。8)孵育完成后每孔加入25ul链亲和素藻红蛋白，用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，再孵育30分钟。9)于Luminex系列液相芯片分析仪上读取结果。仪器可自动绘制标准曲线，并计算出待测样品的测值。4.实验结果分析-请参见表l一表3和图l一图5。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>Std52942250002290021182500026600Std611889.51000001050005325.510000097900表2cTnlGP朋MFI预期浓度(pg/ml)实测浓度(pg/ml)MFI预期浓度(pg/ml)实测浓度(pg/ml)Stdl549.779.8911297.798.8Std215039.0638.2203390.6386Std3724156.251647441562.51590Std42425625592273862506050Std568742500255064982500027000Std6140871000010000903410000092800表3H-FABPMFI预期浓度(pg/ml)实测浓度(pg/ml)Stdl27.597.793.3Std2111390.6402Std33361562.51550Std497162506250<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本发明所公开的心肌梗塞早期诊断液相芯片只需25uL的血清样本即可一次反应同时完成五种心肌损伤标志物的定量检测。同时，与放射免疫，化学发光检测及酶联免疫吸附等方法相比，液相芯片平台检测范围更宽，灵敏度更高，重复性更好。由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。通过对CK-MB、Mb、cTnl、GPBB及H-FABP捕获抗体和检测抗体的配对，我们找到了适用于这五种心肌损伤标志物检测的最优抗体对。通过标准曲线的分析，可以看到本发明所提供的心肌梗塞早期诊断液相芯片对心肌损伤标志物的检测具有很高的检测灵敏度和特异性。其中，CK-MB、Mb、GPBB及H-FABP标准曲线的线性在97.7pg/ml100ng/ml的浓度范围内R2^0.99，最低检测限可达97.7pg/ml。cTnl的标准曲线在9.77pg/ml10ng/ml的浓度范围内R2》0.99，最低检测限可达9.77pg/ml，且各个标准点的实测浓度与预期浓度的相对误差不超过8%。因此，本发明提供的心肌梗塞早期诊断液相芯片能对血清中心肌损伤标志物极微量的变化进行检测，并且能一次性检测五种在急性心肌梗塞早期诊断中价值各异的心肌标志物，从而提高急性心肌梗塞诊断的准确率，同时为急性心肌梗塞的病情监测及预后判断提供重要依据。权利要求1.一种心肌梗塞早期诊断液相芯片，其特征是，主要包括有1)包被微球含有分别包被了CK-MB捕获抗体的微球，包被了Mb捕获抗体的微球，包被了cTnI捕获抗体的微球，包被了GPBB捕获抗体的微球，和包被了H-FABP捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；2)生物素标记检测抗体含有分别用生物素标记的CK-MB、Mb、cTnI、GPBB及H-FABP的检测抗体；和3)链亲和素藻红蛋白。2.根据权利要求l所述的心肌梗塞早期诊断液相芯片，其特征是，每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为110-140个4il;每种生物素标记检测抗体的使用浓度为1-3ug/ral。3.根据权利要求2所述的心肌梗塞早期诊断液相芯片，其特征是，每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为120个&1;每种生物素标记检测抗体的使用浓度为2ug/ml。4.一种制备权利要求1所述心肌梗塞早期诊断液相芯片的方法，主要包括以下步骤(1)每种相应的捕获抗体包被微球-将50pL微球活化后，28000g，离心；-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-28(HiL50mM的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s，后将微球于28000g，离心l-2min;重复该步骤；-吸弃上清，将微球重悬于100pL50mMpH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2吗抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550pL;-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr;-偶联了抗体后的微球以28000g的速度，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于500nLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声振荡约20s;隱室温避光振荡30min;再于^8000g，离心l-2min;-吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约20s，超声约20s;微球上8000g，离心l-2min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于500-1000nLPBS-TBN溶液中；-每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8'C避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为110-140个/pl;(2)每种检测抗体的生物素标记-依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积；-用DMSO溶解，配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；-按摩尔比l:IOO于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液；-加入体积为目标体积的pH8.9的1/10的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS补至目标体积；-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25'C恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为800rpm-1000rpm;-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin;-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合，使每种检测抗体最终浓度达到1-3ug/ml。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述活化微球的步骤如下-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；-取50pL微球离心l-2min;-去掉上清夜，将微球重悬于100pL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约20s，28000g离心1一2min;-吸弃上清，加入80pL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约20s;-加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-加入10pL50mg/mLEDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温避光静置20min,每10min用涡漩振荡器轻轻地混匀。全文摘要本发明公开了一种心肌梗塞早期诊断液相芯片，主要包括有包被微球含有分别包被了CK-MB捕获抗体的微球，包被了Mb捕获抗体的微球，包被了cTnI捕获抗体的微球，包被了GPBB捕获抗体的微球，和包被了H-FABP捕获抗体的微球；分别用生物素标记的检测抗体；链亲和素藻红蛋白。本发明所提供的心肌梗塞早期诊断的液相芯片具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点。同时，各项心肌损伤标志物可自由组合，使用方便。同时，由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。文档编号G01N33/533GK101271108SQ20081002575公开日2008年9月24日申请日期2008年1月11日优先权日2008年1月11日发明者林一群,许嘉森申请人:广州益善生物技术有限公司