专利名称：自身抗体平行检测液相芯片及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉一种液相芯片及其制备方法与应用，尤其涉及一种用于自身免疫性疾病诊断的自身抗体检测平行检测液相芯片及其制备方法与应用，属于免疫技术及临床检测技术领域。
背景技术：
自身免疫性疾病在人群中的发病率是3-5％，尤其是在老年人中发病率最高。这类疾病最普遍的特点是血清中出现自身抗体，而且不同的自身抗体谱可以区分这类疾病中的各种疾病。目前国际上通用的自身免疫性疾病的诊断标准除了相应的临床症状外，其诊断主要还依据患者的血清中检测到自身抗体。风湿病在早期很难诊断，但是在疾病的晚期，全身多个器官系统都会被累及，给病人造成巨大的痛苦，所以需要一种灵敏度高而全面的诊断方法，而目前自身抗体的检测主要采用免疫学方法，常用的有免疫印记、免疫荧光、酶联免疫吸附实验等，这些方法一次只能检测一个抗体，在实际应用过程中对于抗体谱的检测既繁琐又需要相对大量的试剂和临床标本，临床检测费用高，因此如果能将运用新的技术将这些抗体进行同时检测，将会对这一类疾病的诊疗提供极大的方便。目前日益成熟的生物芯片技术的高通量的特点可以实现把多种自身抗体一次性的联合检。液相芯片技术是生物芯片的一种，它除了可以同时检测多种自身抗体以外，还具有较ELISA反应更加充分的液相反应特点，又具有定量性好，省时省力的优点。因此，研制和开发一种自身抗体平行检测液相芯片是目前临床诊断的必需。
发明内容
根据自身免疫性疾病多表现为多样化的自身抗体谱的出现的临床特点，针对现有自身抗体目前采用的ELISA检测、免疫荧光等单个检测一次只能检测一种自身抗体技术的不便和临床诊断的需要，本发明要解决的问题是提供一种自身抗体平行检测液相芯片及其制备方法与应用，为自身免疫性疾病的早期发现、早期诊断和早期治疗提供一种方便的、准确的临床检测方法以及检测试剂盒。
本发明的自身免疫性疾病平行检测液相芯片，主要由微球，自身抗原，生物素化的二抗，链霉亲和素-藻红蛋白组成，其特征是，所述微球是28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92号微球；所述自身抗原是ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1；Scl-70，PCNA，环状聚丝蛋白(CCP)，组蛋白，CENP-B，rRNP，U1RNP，α-胞衬蛋白多肽，角蛋白；所述生物素化的二抗是经活化的生物素标记的羊抗人IgG；所述自身抗原和生物素化的二抗均能特异与其相应的自身抗体结合。
其中所述ANAs抗原与28号微球形成偶联体，dsDNA与32号微球形成偶联体，SSA/Ro-60与36号微球形成偶联体，SSA/Ro-52与38号微球形成偶联体，SSB/La与46号微球形成偶联体，Jo-1与48号微球形成偶联体；Scl-70与56号微球形成偶联体，PCNA与58号微球形成偶联体，环状聚丝蛋白(CCP)与66号微球形成偶联体，组蛋白与68号微球形成偶联体，CENP-B与76号微球形成偶联体，rRNP78号微球形成偶联体，U1RNP与86号微球形成偶联体，α-胞衬蛋白多肽与88号微球形成偶联体，角蛋白与92号微球形成偶联体；所述偶联体是一种球形基质。
以红色激光激发球形基质上的红色分类荧光，依据球形基质的色彩不同确定类型；所述生物素化二抗与链霉亲和素-藻红蛋白结合，以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的自身抗体的含量。
本发明共确定了15种用于自身免疫性疾病诊断的自身抗体检测的自身抗原，并利用所述抗原分别检测其相应的抗体，分别是ANAs抗体，dsDNA抗体，SSA/Ro-60抗体，SSA/Ro-52抗体，SSB/La抗体，Jo-1抗体，抗Scl-70抗体、抗PCNA抗体，抗CCP抗体，抗组蛋白抗体，抗着丝点抗体(ACA，RA33抗体)，抗rRNP抗体，抗U1RNP抗体，α-胞衬蛋白抗体，抗角蛋白抗体。本发明所涉及的15种自身抗体，是在大量临床应用的基础上，证实确有与自身免疫性疾病的发生有密切关系而选择的。
优选的，所述生物素化的二抗是生物素化山羊抗人IgG(H+L)。
优选的，所述28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92号微球是经洗涤、活化的羧基微球。
生物素化的二抗是用于识别自身抗体的另一类抗体，其作用是将液相芯片微球体结合的自身抗体与检测荧光偶联，间接将结合的标记物的浓度与检测荧光的强度结合起来，从而实现对每种自身抗体的浓度进行定量测定。生物素化山羊抗人IgG(H+L)通过生物素与avidin-R-PE结合，最后通过Luminex100检测系统对每一种自身抗体进行定性定量检测。
本发明的设计思路是选择自身免疫性疾病产生的自身抗体所针对的抗原，分别与不同色号的微球偶联，制备出可对上述自身抗体进行一次性平行检测的液相芯片，在应用时，加入待检血清，使血清中的自身抗体被微球上的抗原捕获，再与生物素标记的二抗共同孵育，然后与链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PA)反应，通过Luminex100检测系统，实现对上述自身抗体一次性定量检测。
本发明所述自身免疫性疾病平行检测液相芯片的制备方法，其步骤是(1)自身抗原与微球偶联形成偶联体分别选取28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92号羧基微球，洗涤；活化羧基微球；以上述顺序分别对应地加入ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1；Scl-70，PCNA，环状聚丝蛋白(CCP)，组蛋白，CENP-B，rRNP，U1RNP，a-胞衬蛋白，角蛋白；混匀；室温下，以200～250rpm的转速放在摇床上孵育30～120分钟；重复1～2次；用PBS-TBN洗涤2～3次；ANAs抗原与28号微球形成偶联体，dsDNA与32号微球形成偶联体，SSA/Ro-60与36号微球形成偶联体，SSA/Ro-52与38号微球形成偶联体，SSB/La与46号微球形成偶联体，Jo-1与48号微球形成偶联体；Scl-70与56号微球形成偶联体，PCNA与58号微球形成偶联体，环状聚丝蛋白(CCP)与66号微球形成偶联体，组蛋白与68号微球形成偶联体，CENP-B与76号微球形成偶联体，rRNP78号微球形成偶联体，U1RNP与86号微球形成偶联体，α-胞衬蛋白多肽与88号微球形成偶联体，角蛋白与92号微球形成偶联体；计数每种微球偶联体的单位体积数，确定浓度，分别于4℃条件下避光保存；使用时，依据检测项目选择混合；
(2)将标记有探针的球形基质即自身抗原与微球偶联的偶联体、报告分子即活化的生物素标记的二抗、链霉亲和素-藻红蛋白与待测样品混合，静置。得到本发明的自身抗体平行检测液相芯片。
生物素化二抗的选择优选生物素化山羊抗人IgG(H+L)，用于将链霉亲和素-藻红蛋白结合到微球上。
本发明所述自身抗体平行检测液相芯片在制备临床检测试剂中的应用。
将标记有探针的球形基质即自身抗原与微球偶联的偶联体、报告分子即活化的生物素标记的二抗、链霉亲和素-藻红蛋白与待测样品混合，静置，探针可以与相应的目的分子特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子也与目的分子特异性的结合，将混合物上样到Luminex 100，采用微流技术将微球偶联体分为单个细胞流，利用红、绿两束激光检测，获得光信号、处理数据就可完成对生物反应的实时、定量分析。
利用本发明的自身抗体平行检测液相芯片，可以实现对多种自身抗体的平行检测，即可同时检测15种自身抗体，也可以根据临床需要选择性的测量其中的几个抗体，方便不同的疾病的临床检测需要。
本发明的方法由于将多种自身抗体的检测在一个反应体系中进行，不同的探针可以和不同的目的分子进行结合，反应后通过激光检测球形基质的色彩编号可以对不同的检测反应加以区分，既具有ELISA检测的定性定量的优点，又具有高通量的特点，因而可更加省时省力，同时节约了检测成本。
图1是实施例3经曲线拟合后所得标准曲线，平均荧光强度分别为261.5、908、1475、4422和6654.5，以标准抗体的浓度的对数值为横坐标，平均荧光强度值为纵坐标拟合标准曲线。
图2是实施例4经曲线拟合后所得标准曲线，平均荧光强度分别为378、1177、2014、2830.5和7250，以标准抗体的浓度的对数值为横坐标，平均荧光强度值为纵坐标拟合标准曲线。
具体实施例方式
实施例1自身抗原与已知编号的微球的偶联1.分别选取28，38，48，58，68，78号羧基微球(Luminex公司)，用漩涡震荡器振荡微球悬液，时间20秒，使微球混合均匀。
2.分别取上述各号羧基微球大约2×103个，分别转移到离心管中，≥8000×g离心2min，沉淀羧基微球。
3.移走上清，加入100μl dH2O，用漩涡震荡器振荡20秒重悬微球，≥8000×g离心2min，沉淀羧基微球。
4.移走上清，加入80μl、100mM、pH＝6.2的磷酸二氢钠盐溶液，用漩涡震荡器振荡20秒重悬洗涤的羧基微球。
5.加入10μl、50mg/ml的Sulfo-NHS(用dH2O稀释)，用漩涡震荡器轻轻的振荡。
6.加入10μl、50mg/ml的EDC(用dH2O稀释)，用漩涡震荡器轻轻的振荡。室温孵育20min，每隔10分钟用漩涡震荡器轻振一次。≥8000×g离心2min，沉淀活化的羧基微球。
7.移走上清，加入250μl、50mM、pH＝5.0的MES，漩涡震荡器振荡20秒，重悬活化的羧基微球。≥8000×g离心2min，沉淀洗涤后的羧基微球。
8.重复步骤7两次，用50mM、pH＝5.0的MES洗涤2次。
9.加入100μl、50mM、pH＝5.0的MES，用漩涡震荡器振荡20秒。在混匀的微球中分别加入1μg自身抗原ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1；Scl-70，PCNA，环状聚丝蛋白(CCP)，组蛋白，CENP-B，rRNP，U1RNP，a-胞衬蛋白，角蛋白，用50mM、pH＝5.0的MES定容至500μl，用漩涡震荡器混匀。
10.在室温下放在摇床上(200rpm)孵育2小时。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。
11.移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30秒。在室温下放在摇床(200rpm)上孵育30分钟。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。
12.移走上清，加入1ml PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30秒。≥8000×g离心2min，沉淀偶联好的微球。
13.重复步骤12一次，用PBS-TBN洗涤2次。
14.加入500μl PBS-TBN，重悬偶联好和洗涤好的微球，即得ANAs抗原与28号微球的偶联体，dsDNA与32号微球的偶联体，SSA/Ro-60与36号微球的偶联体，SSA/Ro-52与38号微球的偶联体，SSB/La与46号微球的偶联体，Jo-1与48号微球的偶联体；Scl-70与56号微球的偶联体，PCNA与58号微球的偶联体，环状聚丝蛋白(CCP)与66号微球的偶联体，组蛋白与68号微球的偶联体，CENP-B与76号微球的偶联体，rRNP78号微球的偶联体，U1RNP与86号微球的偶联体，α-胞衬蛋白多肽与88号微球的偶联体，角蛋白与92号微球的偶联体。
15.用细胞计数器计数微球的数量，换算出每种微球的浓度。
16.把偶联好的微球放在4℃避光保存，一般每种抗原偶联的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择混合。
实施例2本发明所述自身免疫性疾病平行检测液相芯片在临床检测中的应用(一)利用本发明所述自身抗体平行检测液相芯片检测自身抗体的技术流程1.分别取出上述制备的针对每种自身抗原偶联微球各500个，按等比例混合，分装在96孔板中，每一个孔中含有各种自身抗体偶联微球各500个，加入待检血清50μl，37℃孵育2小时。
2.≥8000×g离心2min，移走上清，加入300μl、1％PBS-BSA，漩涡震荡器振荡30秒，37℃孵箱封闭1个小时。
3.≥8000×g离心2min。移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30秒。≥8000×g离心2min。
4.重复步骤3两次。
5.加入上述制备的生物素标记的二抗100μl，摇匀，37℃孵箱孵育30分钟。
6.≥8000×g离心2min，移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30秒。≥8000×g离心2min。
7.重复步骤6两次。
8.加入链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)100μl，摇匀，37℃孵箱孵育30分。
9.≥8000×g离心2min，移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩涡震荡器振荡30秒。≥8000×g离心2min。
10.重复步骤9两次。加入100μl PBS-TBN重悬微球，用于Luminex100进行检测。
11.Luminex100检测中，红色荧光定义微球的种类，绿色荧光测定微球结合的SA-PE的平均荧光强度，根据标准曲线，确定待测样品的自身抗体的浓度。
(二)自身抗体的标准曲线绘制分别根据各种自身抗体的血清学浓度的范围，配备15种自身抗体的标准品，每个标准品设6个稀释度，然后等比例混合，使各自的终浓度为所需的浓度，每孔50μl，反应步骤与待测样品的步骤完全相同，根据测定结果，运用Luminex100仪器分析系统提供的方程拟合各种自身抗体的标准曲线，根据标准曲线，检测系统自动分析出各个待测样品中自身抗体的浓度，实现对15种自身抗体的一次性定量分析。
实施例3自身抗体的标准曲线绘制举例一按实施例1和2所述方法，将SSA/Ro-52(R052)包被到38号微球，包被后取1000个微球加入PE标记的鼠抗人IgG反应30分钟，经Luminex100检测，荧光值达到23000，而没有包被SSA/Ro-52的微球加入PE标记的鼠抗人IgG反应30分钟，经Luminex100检测，荧光值只有100，说明我们包被的微球能够满足芯片开发的要求。
取标准SSA/Ro-52抗体，按0EU/ml、6.25EU/ml、12.5EU/ml、25EU/ml和50EU/ml的梯度稀释，按所述方法反应后，经Luminex100检测，平均荧光强度分别为261.5、908、1475、4422和6654.5。所得标准曲线见图1。并检测血清标本一例，测得结果为1EU/ml，与ELISA结果0.8EU/ml一致实施例4自身抗体的标准曲线绘制举例二在实施例3同样的梯度条件下重复试验一次，Luminex100检测，平均荧光强度分别为378、1177、2014、2830.5和7250。所得标准曲线见图2。并同时检测血清标本3例，所得结果分别为72.4436EU/ml、81.2831EU/ml和67.6083EU/ml，与ELISA检测结果92.931EU/ml、89.513EU/ml和100.743EU/ml相比，结果一致。
以上实施例结果表明本发明所述自身抗体平行检测液相芯片一个反应就可同时检测15种自身抗体，较目前的分项的ELISA及免疫荧光方法的效率提高了15倍。
权利要求
1.一种自身抗体平行检测液相芯片，主要由微球，自身抗原，生物素化的二抗，链霉亲和素-藻红蛋白组成，其特征是，所述微球是28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92号微球；所述自身抗原是ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1；Scl-70，PCNA，环状聚丝蛋白，组蛋白，CENP-B，rRNP，U1RNP，α-胞衬蛋白多肽，角蛋白；所述生物素化的二抗是经活化的生物素标记的羊抗人IgG；所述自身抗原和生物素化的二抗均能特异与其相应的自身抗体结合；其中所述ANAs抗原与28号微球形成偶联体，dsDNA与32号微球形成偶联体，SSA/Ro-60与36号微球形成偶联体，SSA/Ro-52与38号微球形成偶联体，SSB/La与46号微球形成偶联体，Jo-1与48号微球形成偶联体；Scl-70与56号微球形成偶联体，PCNA与58号微球形成偶联体，环状聚丝蛋白与66号微球形成偶联体，组蛋白与68号微球形成偶联体，CENP-B与76号微球形成偶联体，rRNP78号微球形成偶联体，U1RNP与86号微球形成偶联体，α-胞衬蛋白多肽与88号微球形成偶联体，角蛋白与92号微球形成偶联体；所述偶联体是一种球形基质。
2.如权利要求1所述的自身抗体平行检测液相芯片，其特征是，所述生物素化的二抗是生物素化山羊抗人IgG(H+L)。
3.如权利要求1所述的自身抗体平行检测液相芯片，其特征是，所述28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92号微球是经洗涤、活化的羧基微球。
4.权利要求1所述自身抗体平行检测液相芯片的制备方法，其特征是，步骤如下(1)微球与自身抗原偶联形成偶联体分别选取28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92号羧基微球，洗涤；活化羧基微球；以上述顺序分别对应地加入ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1；Scl-70，PCNA，环状聚丝蛋白，组蛋白，CENP-B，rRNP，U1RNP，a-胞衬蛋白，角蛋白；混匀；室温下，以200～250rpm的转速放在摇床上孵育30～120分钟；重复1～2次；用PBS-TBN洗涤2～3次；得ANAs抗原与28号微球形成偶联体，dsDNA与32号微球形成偶联体，SSA/Ro-60与36号微球形成偶联体，SSA/Ro-52与38号微球形成偶联体，SSB/La与46号微球形成偶联体，Jo-1与48号微球形成偶联体；Scl-70与56号微球形成偶联体，PCNA与58号微球形成偶联体，环状聚丝蛋白与66号微球形成偶联体，组蛋白与68号微球形成偶联体，CENP-B与76号微球形成偶联体，rRNP78号微球形成偶联体，U1RNP与86号微球形成偶联体，α-胞衬蛋白多肽与88号微球形成偶联体，角蛋白与92号微球形成偶联体；计数单位体积每种微球偶联体的数，分别于4℃条件下避光保存；使用时，依据检测项目选择混合；(2)将自身抗原与微球偶联的偶联体、活化的生物素标记的二抗、链霉亲和素-藻红蛋白与待测样品混合，静置，得到本发明的自身抗体平行检测液相芯片。
5.权利要求1所述自身抗体平行检测液相芯片在制备自身免疫性疾病临床诊断检测试剂中的应用。
6.如权利要求5所述自身抗体平行检测液相芯片的应用，其特征是，将标记有探针的自身抗原与微球偶联的偶联体球形基质、作为报告分子的活化的生物素标记的二抗、链霉亲和素-藻红蛋白与待测样品混合，静置，探针与相应的目的分子特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子也与目的分子特异性的结合，将混合物上样到Luminex 100，采用微流技术将微球偶联体分为单个细胞流，利用红、绿两束激光检测，获得光信号、处理数据就可完成对生物反应的实时、定量分析。
全文摘要
自身抗体平行检测液相芯片及其制备方法与应用，属于免疫技术及临床检测技术领域。主要由微球，自身抗原，生物素化的二抗，链霉亲和素－藻红蛋白组成，所述自身抗原分别与相应的各号微球形成偶联体，以红色激光激发其球形基质上的红色分类荧光，依据其球形基质的色彩不同确定自身抗原的类型；所述生物素化的二抗与链霉亲和素－藻红蛋白结合，以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的各种自身抗体的含量。本发明还公开了所述自身抗体平行检测液相芯片在制备自身免疫性疾病临床诊断检测试剂中的应用。
文档编号G01N21/84GK1866013SQ200610044358
公开日2006年11月22日 申请日期2006年5月31日 优先权日2006年5月31日
发明者高雪芹, 张华宁, 韩金祥, 徐华 申请人:山东省医药生物技术研究中心