脓毒症早期诊断液相芯片及其制备方法

专利名称：：脓毒症早期诊断液相芯片及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及医学体外诊断技术，具体的是涉及脓毒症早期诊断液相芯片及其制备方法。技术背景脓毒症(Sepsis)是严重感染、严重创(烧)伤、休克、外科手术后常见的并发症，是由于微生物(如细菌、病毒、真菌、寄生虫等)侵入人体而诱发的激烈全身炎症反应，并对组织具有损伤性的病理生理过程的一组临床表现。严重脓毒症可以导致脓毒性休克、多器官功能障碍(MODS)，对人类健康和经济发展构成极大的威胁和挑战，已成为非心脏病死亡的主要原因。当前，脓毒症存在着患病率高、病死率高、治疗费用高的三高现象。据统计，脓毒症的患病率约为总人口的0.3%，全球每年发生的总病例数约1800万例，相当于丹麦、芬兰、爱尔兰和挪威人口的总和，仅美国每年患病人数就有75万例。中国虽然没有确切的统计数据，但推算应该不低于每年400万例。不仅如此，资料还显示脓毒症病例数正以每年1.5%的比例增长，预计到2050年，美国人口增加约30%(达到4亿)，但脓毒症病例数将增加l倍以上(达到160万例)。脓毒症的病死率约为28%~50%，平均40%，中国国内不完整的报告数据与此相近，全世界死亡人数每天超过1.4万例，美国每年达到21.5万例，尚有相当的死亡病例没有计算在内而归咎于原发病。脓毒症已经对人类健康产生严重威胁，为经济发展带来巨大负担。在美国，每例患者的平均治疗费用约为2.2万美元，年耗资近200亿美元，欧洲年耗资近100亿美元。我国没有这方面的确切数据，凭经验估计每例患者的平均治疗费用不会低于美国，因此治疗总耗资相当可观。准确及时诊断早期脓毒症、指导脓毒症的治疗和判断预后是目前icu(重症监护病房)所面临的一个棘手难题。尽管现代医疗技术和重症监护水平明显提高，但严重脓毒症、脓毒性休克或多器官功能障碍综合征(MODS)等并发症的病死率仍高达50%~70%。目前临床上对严重脓毒症或MODS尚缺乏切实有效的预警指标和监测方法。由于危重病人全身性炎症反应，感染与非感染临床表现相互混淆，脓毒症的传统诊断指标如体温(TEMP)、白细胞计数(WBC)、血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)等都是非特异性的，且可靠性不强。现有的实验诊断方法包括早期病原体诊断和血清学指标检测。早期病原体运用细菌16srRNA基因扩增的方法检测细菌，从而判断细菌的存在与否及常见细菌的种类。这种技术具有快速、灵敏度高、不受抗生素治疗影响等优点。其不足之处是会出现假阳性，且目前价格较昂贵。血清学指标检测目前常用的标志物有降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)及新喋呤等。一些欧洲国家用PCT作为鉴别系统性炎症反应综合症(SIRS)和脓毒症的一个指标，并且有相关的商用试剂产品销售，但也有人对该指标持有异议，认为其过于敏感。CRP也被作为诊断及监测脓毒症的一个参数。遗憾的是单一标志物始终存在着特异性不强，阳性率较低等不足，只能作为脓毒症诊断和监测的参考，不能作为诊断脓毒症的真正的特异性指标。PCT特异性好，化学性能稳定，在早期预测脓毒症及其预后有较大潜力，但其敏感性稍差，配合敏感性好的新喋呤和C反应蛋白，可进一步提高其预测效率。脓毒症时IL-6的升高比这些急性期蛋白升高出现得更早。联合检测这些指标可以提高检测的灵敏度和准确度，可以用来对脓毒症进行早期诊断和判断预后。本发明根据大量文献资料，确定联合应用降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)和新喋呤这四项指标来综合评估脓毒症及其预后，进而及时地进行早期干预，防止脓毒症的进一步恶化和改善患者预后。(1)C反应蛋白(CRP):CRP于1930年在肺炎病人血清中发现，可以与肺炎球菌的多聚糖片断C发生反应并沉淀。正常人群CRP水平在10mg/L以下，脓毒症患者CRP在感染发生后46h即开始升高，3650h达到高峰，峰值可达正常参考值的数百倍，感染消除后其含量急骤下降，l周内可恢复至正常。CRP在病毒感染时无显著升高，可以用来区别感染性炎症和其他类型的炎症，检测敏感性为92.1%，特异性为82.1%。CRP在疾病整个过程中浓度分布超过正常值，但与病情严重程度无关。(2)降鈞素原(PCT):PCT最早发现于1986年，是无激素活性的降钙素(CT)前肽物质。正常条件下血中PCT小于0.5ng/ml或检测不到，感染后迅速上升，2小时左右可在血中检测到，1224小时达到峰值，严重感染时可上升到正常值的2000倍以上。PCT在全身性炎症反应(2-3小时后)早期即可升高，具有早期诊断价值。在局部感染、病毒感染、慢性非特异性炎症、癌性发热、移植物宿主排斥反应或自身免疫性等疾病时PCT浓度不增加或轻微增加，只在严重的全身系统性感染时才明显增加，具有高度特异性，可用于各种临床情况的鉴别诊断。PCT可以监测脓毒症的发生发展过程，其血浆浓度与感染和脓毒症疾病严重程度和活动程度成正比。PCT可以确定预后和疗效，其水平持续增高是预后不好的有力标志，水平下降标志着预后良好，连续进行血浆PCT含量测定，有助于早期预测和识别MODS的发生。PCT在区分细菌感染和非感染性炎症方面具有很好的特异性，达81%;对严重脓毒症和脓毒性休克具有高达100%的特异性。(3)白细胞介素6(IL-6):IL-6是细胞因子的核心成员，发现于1980年。IL-6在血中代谢较慢，容易检测，因而被作为脓毒症的重要标志物。IL-6的升高比其他的急性期蛋白升高出现得更早，因此，检测血中IL-6具有早期诊断优势。同时，IL-6具有较好的敏感性和特异性，分别为81.1%和78.9%。许多研究显示脓毒症病人血IL-6水平明显增高，且增高幅度与脓毒症的严重程度、脓毒性休克和不良预后相关。IL-6水平持续增高病人多脏器功能不全(M0DS)和死亡率明显增加。(4)新喋呤新喋呤(neopterin)是体内三磷酸鸟苷代谢衍生的低分子量喋啶类化合物。新喋呤与脓毒症等感染的病理过程密切相关，24小时内有休克倾向者血清水平明显改变，对脓毒性休克的发生具有显著的预测意义。新喋呤诊断MODS的敏感性、特异性和准确性为83.0%、88.5%和86.6%，其阳性预测值和阴性预测值则为79.6%和90.6%。连续测定新喋呤的含量可能有助于及早预测和识别MODS的发生，为早期干预奠定基础。新喋呤的持续升高与严重烧伤后脓毒症的发生与发展密切相关，烧伤可引起血清新喋呤升高。新喋呤可以预测新生儿脓毒症，并可以区分细菌感染和病毒感染，连续监测可以早期诊断坏死性小肠结肠炎。传统的抗原检测方法主要有放射免疫法，酶联免疫法及电化学发光免疫法等。然而这些方法每次测试只能获得一种待测物的浓度。同时，传统的免疫检测方法受灵敏度限制，因此对于一些低浓度的血清蛋白物质存在检测结果不准确等缺陷。
发明内容本发明的目的是针对目前脓毒症的检测、预后及疗效评估方法的敏感性和特异性不高，不能区分细菌和病毒感染以及一次反应只能检测一种标志物的缺陷，提供一种可以四种标志物联检的脓毒症早期诊断液相芯片。实现上述目的的技术方案如下一种脓毒症早期诊断液相芯片，包括有1)包被微球含有分别包被了PCT捕获抗体的微球，包被了CRP捕获抗体的微球，包被了IL-6捕获抗体的微球，和包被了新碟呤捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码，-2)生物素标记检测抗体含有分别用生物素标记的PCT、CRP、IL-6及新碟呤的检测抗体；3)链亲和素藻红蛋白。优选为，每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为110—140个/W，更优选为120/^1;每种生物素标记检测抗体的使用浓度为l-3ug/ml，更优选为2ug/ml。液相芯片技术也叫流式荧光技术，该技术由一种微球作为反应载体，微球用聚苯乙烯材料制成，直径5.6um，表面有活性羧基可供化学偶连用。抗原、抗体等生物大分子可通过氨基与微球表面的羧基通过化学反应共价结合(即包被过程)。在微球制造过程中加入红外和远红外两种荧光染料，根据两种染料混合比例的不同将微球进行编码，可区分出上百种不同编码的微球。使用时，先将PCT、CRP、IL-6及新碟呤的捕获抗体分别包被于不同颜色编码的微球上，同时分别用生物素标记PCT、CRP、IL-6及新碟呤的检测抗体。将包被好的四种微球混合，悬浮于液相，再加入待检测标本，在悬液中微球上标记的捕获抗体与标本中相应的检测物的某一个表位异性地结合，之后加入生物素标记的检测抗体与标本中相应检测物的另一表位特异性结合，反应完全后加入荧光物质——藻红蛋白标记的链亲和素，由于链亲和素藻红蛋白(SA-PE)可以与生物素高度特异性结合，因此反应体系中最后形成"微球-捕获抗体+待检测物+生物素标记的检测抗体+8八-￡"的四种复合物，以微球为载体，通过Luminex系列液相芯片分析仪器检测，读取微球的色彩编号及SA-PE的荧光值。微球色彩编号可辨别检测项目，SA-PE荧光值与各检测物浓度呈正相关，通过测定PCT、CRP、IL-6及新碟呤标准品在不同浓度下的荧光值，可以获得各个检测指标标准品浓度-荧光值标准曲线以及标准曲线方程。将待测血清样本检测所得荧光值代入标准曲线方程即可分别求得待测样本中的PCT、CRP、IL-6及新碟呤的量。由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。本发明另一需要解决的技术问题是提供上述脓毒症早期诊断液相芯片的制备方法。一种脓毒症早期诊断液相芯片的制备方法，主要包括以下步骤(1)相应的捕获抗体包被微球-将50pL微球活化后，^15000rpm,离心；-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280pL50mM的MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid)的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin，后将微球于^15000rpm，离心8—12min;重复该歩骤；-吸弃上清，将微球重悬于100nL50mMpH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin;-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2(ag抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550nL;-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr;-偶联了抗体后的微球以^12000g的速度，离心8—12min;-吸弃上清，将微球重悬于500pLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin;-室温避光振荡30min;再于^12000g，离心8—12min;-吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin;微球^12000g，离心4一6min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于500-1000^iLPBS-TBN溶液中；-每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8"C避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为120个/pl:(2)每种检测抗体的生物素标记.--依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积；-用DMSO(Dimethylsulfoxide)溶解，配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；-按摩尔比1:100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液；-加入体积为目标体积的1/10的pH8.9的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS补至目标体积；-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25'C恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为800rpm-1000rpm;-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin;-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合。所述活化微球的步骤如下-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；-取50pL微球离心8—10min;-去掉上清夜，将微球重悬于lOOpL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约30s，215000rpm离心1—2min;-吸弃上清，加入8(HiL的磷酸盐缓冲液(pH6.2),涡漩振荡约20s,超声波悬浮微球约lmin;-加入1050mg/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀，超声处理lmin;-加入10nL50mg/mLEDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温震荡反应约20min。本发明所公开的多项脓毒症标志物并行检测液相芯片可一次反应同时完成多种脓毒症标志物的定性定量检测，从而达到对早期脓毒症的准确诊断和预后评估。本发明所提供的多项脓毒症标志物并行检测液相芯片具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点。本发明方法结合液相芯片平台高通量、准确灵敏的特性与双抗体夹心法高灵敏度的特性，同步检测4种脓毒症特异性标志物，提高脓毒症早期诊断的敏感性和特异性，区分细菌和病毒感染引起的脓毒症，判断脓毒症的严重程度和不良预后，连续监测以判断病人对某种治疗方法的反应。另外，本发明的制备方法简单易行，稳定性好，其技术方案中的各种工艺参数如微球和抗体的浓度、反应过程等均是在大量试验基础上得出的，为制备过程最佳的参数值。图1是检测PCT的标准曲线示意图；图2是检测CRP的标准曲线示意图；图3是检测IL-6的标准曲线示意图；图4是检测新碟呤的标准曲线示意图。具体实施方式实施例1脓毒症早期诊断液相芯片的制备及抗原的检测本发明所述的捕获抗体为分别能对应与CRP、PCT、IL-6、及新喋呤特异性结合的单克隆抗体；本实施例所用的CRP捕获抗体为CRP的单克隆抗体，克隆号为C2，检测抗体为CRP的单克隆抗体，克隆号为C6，均购自Hytest公司；PCT捕获抗体为PCT的单克隆抗体，克隆号为14C12,检测抗体为PCT的单克隆抗体，克隆号为38F11，均购自Hytest公司；IL-6捕获抗体为IL-6的单克隆抗体，克隆号为6708，购自R&D公司，检测抗体为IL-6的多克隆抗体，购自abcam公司；新喋呤的捕获抗体为新喋呤的单克隆抗体，克隆号为117/14E10，购自Alexis公司，检测抗体为新喋呤的多克隆抗体，购自abcam公司。本实施例中，所述各种溶液的配方如下1.50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.PBS配方:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3.PBS-TBN配方(即PBS中含O.1%BSA，0.02%Tween-20，0.05%Na3N，pH7.4)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>l.脓毒症早期诊断液相芯片试剂盒，包括有:1)4-plex包被微球含有分别包被了PCT捕获抗体的20号微球，包被了CRP捕获抗体的38号微球，包被了IL-6捕获抗体的53号微球，包被了新碟呤捕获抗体的72号微球。2)4-plex生物素标记检测抗体含有分别用生物素标记的PCT、CRP、IL-6及新碟呤的检测抗体；3)链亲和素藻红蛋白(SA-PE，10ug/ml);还按照现有技术配套有4)分析缓冲液；5)4-plext示7隹品；6)质控液I;7)质控液n;8)血清基质液；9)封口膜；10)滤板。2.制备上述液相芯片试剂盒，包括有如下步骤(1)按上述试剂盒的组成，每种捕获抗体包被相应的微球，制备方法相同-分别选取20号、38号、53号、72号微球(美国Luminex公司)，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球，大约30s;-各取50pL微球于1.5ml的离心管中，15000rpm离心10min;-小心去掉上清夜，将微球重悬于IO(VL的双蒸水中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin:15000rpml2000g离心10min;-吸弃上清，加入80pL的磷酸盐缓冲液(pH6.2)，涡漩振荡约30s,超声处理lrnin;-加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀，超声处理lmin;-力口入10pL50mg/mLEDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温震荡反应约20min;-活化后的微球，215000rpm，离心10min;-吸弃上清，将微球重悬于250pL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin;微球^15000rpm，离心10min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于lOOpL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin;-往每种悬浮的微球中加入相应的l叱抗体，用50mM的MES(pH5.0)溶液将总体积补至500pL;-用涡漩振荡器混匀，25。C避光振荡2hr(转速900rpm);-偶联抗体后的微球以^12000g的速度，离心10min;-吸弃上清，将微球重悬于500pLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin;-室温避光振荡30min;-微球^12000g，离心10min;-吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin;微球212000g，离心5min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于600nLPBS-TBN溶液中；-包被好的微球通过luminex仪器计数；-包被好的微球置于2-8'C避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，依据检测项目选择等比例混合。(2)按上述试剂盒的组成，每种检测抗体的生物素标记-依据蛋白浓度计算反应体系；-依据蛋白浓度计算抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积(V);-配置NHS-Biotin反应液(用DMSO溶解，使其浓度为10mg/ml);-按摩尔比l:IOO于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin(10mg/ml)反应液；-加入1/10目标体积的NaHC03(pH8.9)溶液；-加入PBS(pH7.4)补至目标体积；-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25'C恒温箱中避光孵育4h，转速为900rpm;-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin;-测定蛋白浓度。3.用于检测，包括如下步骤1)使用前先取出所有试剂，放置平衡至室温。2)标准品的稀释每个标准品设6个稀释度，然后等比例混合，使各自得终浓度为所需的浓度。各管稀释方法及理论浓度(同下表中的预期浓度)注意每个浓度标准品稀释完后均必须用涡旋混合仪彻底混匀后才可用于下一浓度的稀释。混匀过程避免产生泡沫。3)设置96孔板布局，确定96孔板上标准品、质控品、待测样品及空白孔的位置。考虑到仪器读数的顺序是按照从第1列到第12列、从第A行到第H行的顺序纵向读数，在设置96孔板布局时应遵循从第1列到第12列、从第A行到第H行的顺序排列。4)按照设置好的96孔板布局，每孔加25^1分析缓冲液，再分别加入25ul标准品、质控品到各自孔中，空白孔加25ul分析缓冲液。5)分别取出上述制备的针对四种脓毒症特异性标志物检测的捕获抗体偶联微球，用涡旋混合仪混匀30钞，超声处理30秒，按等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联的微球浓度均为120个4U。往每孔中加入的四种捕获抗体偶联微球的混合悬液25pl。包被微球应在临用前混匀，且混匀后应立即使用，否则放置过久微球会再沉淀。6)用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，孵育60分钟。7)孵育完成后每孔加入25ul上述制备的生物素标记的检测抗体的混合液(其中所述四种生物素标记的检测抗体事先按等比例混合，使每种检测抗体最终浓度达到2ug/ml，摇匀)，用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，再孵育60分钟。8)孵育完成后每孔加入25ul链亲和素藻红蛋白，用封口膜封住所有加样孔口，并用锡箔纸包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振荡器上以600转速度震荡，再孵育30分钟。9)于Luminex系列液相芯片分析仪上读取结果。仪器可自动绘制标准曲线，并计算出待测样品的测值。4.实验结果分析实验结果如表l、表2(请参见图1至图4)本发明所公开的多项脓毒症标志物并行检测液相芯片只需25^L的血清样本即可一次反应同时完成四种脓毒症标志物的定量检测。同时，与放射免疫，化学发光检测及酶联免疫吸附等方法相比，液相芯片平台检测范围更宽，灵敏度更高，重复性更好。由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。通过对CRP、PCT、IL-6及新喋呤捕获抗体和检测抗体的配对，我们找到了适用于这四种脓毒症标志物检测的最优抗体对。通过标准曲线的分析，可以看到本发明所提供的脓毒症早期诊断液相芯片对四种脓毒症标志物的检测具有很高的检测灵敏度和特异性。其中，PCT与IL-6标准曲线的线性在9.77pg/ml10ng/ml的浓度范围内R220.99,最低检测限可达9.77pg/ml。CRP的标准曲线在97.7pg/ml100ng/ml的浓度范围内R2^).99，最低检测限可达97.7pg/ml。新喋呤的标准曲线在2.44pmol/ml2.5nmol/ml的浓度范围内R220.99，最低检测限可达2.44pmol/ml，且各个标准点的实测浓度与预期浓度的相对误差不超过8%。因此，本发明提供的脓毒症早期诊断液相芯片能对血清中四种脓毒症标志物极微量的变化进行检测，并且能一次性检测四种诊断价值各异的血清标志物，从而提高早期诊断及鉴别诊断的准确率。同时，能区别脓毒症和其他原因引起的SIRS，区分细菌和病毒感染引起的脓毒症，为针对性的治疗提供依据，判断脓毒症的严重程度和不良预后，连续监测以判断病人对某种治疗方法的反应。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>权利要求1.一种脓毒症早期诊断液相芯片，其特征是，主要包括有1)包被微球含有分别包被了PCT捕获抗体的微球，包被了CRP捕获抗体的微球，包被了IL-6捕获抗体的微球，和包被了新碟呤捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；2)生物素标记检测抗体含有分别用生物素标记的PCT、CRP、IL-6及新碟呤的检测抗体；3)链亲和素藻红蛋白。2.根据权利要求l所述的脓毒症早期诊断液相芯片，其特征是，每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为110—140个4d;每种生物素标记检测抗体的使用浓度为l-3ug/ml。3.根据权利要求2所述的脓毒症早期诊断液相芯片，其特征是，每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为120个4d;每种生物素标记检测抗体的使用浓度为2ug/ml。4.一种制备如权利要求1所述脓毒症早期诊断液相芯片的方法，主要包括以下步骤-(1)每种相应的捕获抗体包被微球-将50^iL微球活化后，^15000rpm，离心；-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280pL50mM的MES的溶液中，涡漩振荡约30s,超声处理lmin，后将微球于^15000rpm，离心；重复该步骤；-吸弃上清，将微球重悬于100pL50mMpH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin;-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2^g抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550iaL;-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr;-偶联了抗体后的微球以^12000g的速度，离心8-12min;-吸弃上清，将微球重悬于50(^LPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s,超声处理lmin;-室温避光振荡30min;再于^12000g，离心8—12min;-吸弃上清，将微球重悬于lmLPBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理lmin:微球^12000g，离心4一6min;重复该步骤一次；-吸弃上清，将微球重悬于500-100(VLPBS-TBN溶液中；-每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8'C避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为110-140个/pl;(2)每种检测抗体的生物素标记-依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，视为目标体积；-用DMSO溶解，配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；-按摩尔比l:IOO于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液；-加入体积为目标体积的1/10的pH8.9的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS补至目标体积；-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25匸恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为800rpm-1000rpm;-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin:-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合，使每种检测抗体最终浓度达到l-3ug/ml。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述活化微球的步骤如下-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；-取50(aL微球离心8—10min;-去掉上清夜，将微球重悬于100pL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约30s，超声处理lmin，^15000rpm离心8—12min;-吸弃上清，加入80nL的磷酸盐缓冲液，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约lmin;-加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀，超声处理lmim-力口入10nL50mg/mLEDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；-室温震荡反应约20min。全文摘要本发明公开了一种脓毒症早期诊断液相芯片，主要包括有含有分别包被了PCT捕获抗体的微球，包被了CRP捕获抗体的微球，包被了IL-6捕获抗体的微球，和包被了新碟呤捕获抗体的微球，上述微球具有不同颜色编码；分别用生物素标记的检测抗体；链亲和素藻红蛋白。本发明所提供的脓毒症早期诊断液相芯片具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点。同时，同步检测4种脓毒症特异性标志物，提高脓毒症早期诊断的敏感性和特异性，区分细菌和病毒感染引起的脓毒症，判断脓毒症的严重程度和不良预后，连续监测以判断病人对某种治疗方法的反应。文档编号G01N33/543GK101246163SQ20081002611公开日2008年8月20日申请日期2008年1月29日优先权日2008年1月29日发明者林一群,许嘉森,谢建平申请人:广州益善生物技术有限公司