专利名称：一种用于26种人乳头瘤病毒的检测与分型的方法
技术领域：
本发明属生物技术，涉及分子生物学和生物化学等领域，尤其是涉及人乳头瘤病毒基因检测的悬浮芯片技术，适用于临床检测人乳头瘤病毒及基因分型，以指导宫颈癌的防治工作。
背景技术：
人乳头瘤病毒作为人类致病微生物严重威胁着人类的健康，目前已有100多种不同型别的HPV被鉴定，不同型的HPV可导致不同的疾病。HPV感染已被流行病学和生物学证明是引起宫颈癌及其癌前病变的首要原因，对HPV进行检测及分型是一种有效的、可靠的宫颈癌筛查手段。由于HPV体外增殖非常困难，到目前为止尚无可靠的血清学分型方法。传统的HPV检测方法主要是通过形态学和免疫组化法对其进行检测，如巴氏涂片法，液基层细胞学检查，阴道镜检查，组织病理学检查，电镜直接观察HPV病毒颗粒，放射免疫沉淀法检测患者血清中HPV16抗体水平，酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中HPV-E6，E7特异性抗体等。这些检测方法的灵敏度和特异性均不够理想，存在较高的假阳性率和假阴性率，且不能对HPV进行分型。常用的分型方法有PCR、原位杂交、线样探针分析、等，他们存在易污染、假阳性率高、灵敏度不高、操作烦琐、对混合感染难以判断、价格昂贵等缺点，难以推广应用。
最近十几年来，许多科学工作者为了克服传统检测方法的不足，采用现代分子生物学技术方法对HPV进行检测，这些方法主要包括核酸杂交法，聚合酶链反应PCR法。这些方法有的灵敏度不高，有的特异性差，有的比较费时间，有的易发生交叉感染，假阳性率高，有的操作烦琐且不能分型。
随着分子生物学技术的飞速发展，基因芯片技术已被广泛应用于病原微生物的检测中，并发挥着巨大的作用。
基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球体为载体的悬浮芯片技术。该项技术是利用微球体作为载体，荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量测定。不同的微球体种类可以标记上比例不同的2种荧光作为微球的编号。当不同编号的微球体依次通过荧光检测仪时，仪器对检测到的2种荧光的比例进行分析，从而判断其是哪种微球体。因此，不同的微球体可以放在同一管中通过荧光检测仪，由计算机软件根据荧光比例判断其编号。这些不同编号的微球体标记上不同的探针，就可以检测不同的病原体。目前，luminex公司可提供100种微球供高通量检测用。
发明内容
本发明选用了luminex公司可提供100种微球中的26种微球体。
本发明用于26种人乳头瘤病毒的检测与分型的方法是将HPV 6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV26，HPV31，HPV33，HPV34，HPV35，HPV39，HPV40，HPV42，HPV43，HPV44，HPV45，HPV51，HPV52，HPV53，HPV54，HPV56，HPV58，HPV59，HPV66，HPV68，HPV73，和HPV82这26种人乳头瘤病毒的型特异性探针交联在26种荧光微球上，与被测标本反应后，再与荧光素标记的报告分子反应，通过荧光检测仪检测人乳头瘤病毒的型特异性核酸。
以上所述26种入乳头瘤型特异性探针序列如下表1 HPV特异性探针序列
以上所述26种人乳头瘤型特异性探针在26种荧光微球上的交联是每个探针与相应的荧光微球通过化学交联反应连接在一起。
本发明检测与分型的主要步骤为(1)将标记好探针的微球体与被测标本混合，使之与被测标本中相应的目的分子特异性结合；(2)在步骤(1)中加入链酶亲和素—藻红蛋白复合物；(3)上述步骤的反应物经过荧光检测仪检测，通过检测到的荧光强度判断不同型人乳头瘤病毒的核酸含量。
本发明检测与分型的方法是用于人乳头瘤病毒的检测和分型诊断。
本发明方法进一步描述如下1、每个合成的探针(Invitrogen，Shanghai，China)5’端为一个氨基基团，接着是18个T的间隔臂，然后是30bp的型特异性探针。26个探针分别与相应的不同微球通过化学交联反应而连接在一起，标记后2-8℃避光保存。
2、待测样本的准备将待测标本洗脱、洗涤后，重悬于150μl裂解液，56℃水浴1小时，酚-氯仿-异戊醇法和乙醇沉淀法获得PCR用的DNA。
3、待测样品的扩增与标记PCR反应所使用的是MY09/11引物对，上游引物MY11为5’-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3’，下游引物MY09为5’--CGTCCMARRGGAWACTGATC-3’(M＝A+C；R＝A+G；W＝A+T；Y＝C+T)，5’端修饰生物素Biotin。50-μl的PCR反应体系含5μl的模板DNA，0.1μM的上游引物MY11，0.8μM的生物素标记的下游引物Biotin-MY09，0.2mM的dNTPs，2.5U的Taq DNA聚合酶，1×反应缓冲液，4mM MgCl2。混匀后，95℃变性5分钟，接下去进行40循环95℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，最后72℃延伸5分钟。
4、杂交和上机检测12μlPCR产物或阳性对照或阴性对照，加入38μl的5×SSC杂交液(内含每一种标记有型特异性探针的微球各5000个)。95℃变性5分钟，55℃杂交15分钟。反应结束后，洗涤微球两次。加入25μl藻红蛋白。避光室温反应5分钟。最后，在Luminex100analyzer上进行检测。
本发明的反应原理简述如下荧光标记的微球体，探针分子，被测物和报道分子是该检测系统的4个主要构成部分。反应主要包括3个主要步骤(1)探针分子的固定；(2)将标记好探针的微球体与被测标本反应，探针可以与相应的目的分子特异性结合，带有报道荧光的报道分子也与目的分子特异性结合。(3)反应物经过荧光检测仪检测。
其检测的原理使单个的微球体通过检测通道，并使用双色激光同时对微球体上的2种荧光和报道分子上的报道荧光进行检测，从而确定被测物的种类和数量。
自从利用不同抗体包被不同地址微球体进行多重分析检测的论文发表后，该技术已经在一些方面得到了应用。如用16种细菌16S rDNA的特异探针，对16种细菌进行了鉴定；用不同探针对30个人的HLA-DPB1片段进行SNP分析，所得到结果与测序得到的结果完全一致；用16种抗原从血浆中检测到16种植物过敏原的抗体；将抗IL-6、IL-8的单抗连接在微球体上，检测到IL-6和IL-8。该技术将成为病原体、细胞因子、组织配型中相容性抗原以及自身免疫性疾病高通量、快速、灵敏的检测分析的重要工具。
本申请首次将该技术应用于HPV的基因分型，其积极效果在于目前有关HPV检测分型芯片的研究还不多，我们将基因芯片技术应用于HPV的检测及分型。本研究制备的HPV检测及分型基因芯片是采用基于微球为载体的悬浮基因芯片，可以根据实际需要设计芯片探针数量。
本发明的优点在于1、人乳头瘤病毒基因芯片，能一次检测26种常见类型HPV，大大提高了HPV的检测效率，缩短检测时间。
2、HPV基因芯片检测分型操作简单，通过一次杂交检测不仅可以判断样品中是否存在HPV感染，而且可以鉴定出属于那种类型的感染，便于临床推广应用。
3、HPV基因芯片针对性强，对样品中的HPV-DNA直接进行检测，可以检测出HPV的潜伏期感染，克服了血清学和免疫组化检测方法对潜伏感染会产生漏检的缺陷，从而实现对HPV疾病的早期快速诊断。
4、HPV基因芯片，敏感性高，特异性强。通过基因序列比对设计了HPV特异性寡核苷酸探针，同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照，对芯片的质量进行控制，排除假阳性、假阴性，使检测结果更加可靠。
5、HPV基因芯片能同时检测多种HPV型别，对多重HPV感染的判断一目了然，克服了其他HPV检测方法难以判断混合感染或操作烦琐的缺点。
6、检测结果客观性强，可靠性高。本技术是对多个微球体荧光信号进行单独检测后，用配套的软件进行统计分析，使检测结果更加精确、可靠，大大降低了分析结果判断过程中的人为的主观因素。
具体实施例方式
一、HPV的基因芯片的制作方法如下本发明设计了HPV 6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV26，HPV31，HPV33，HPV34，HPV35，HPV39，HPV40，HPV42，HPV43，HPV44，HPV45，HPV51，HPV52，HPV53，HPV54，HPV56，HPV58，HPV59，HPV66，HPV68，HPV73，和HPV82这26种病毒的型特异性探针，并由上海英骏生物技术有限公司合成。每个合成的探针(Invitrogen，Shanghai，China)5’端为一个氨基基团，接着是48bp的型特异性探针。探针序列见发明内容部分的表1。
每个探针与相应的微球通过交联反应而连接在一起。
具体做法是5×106个羧基化微球悬浮于50μl 100mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)，pH 4.5的反应液中，加入1nmol的氨基化的探针分子，加入25.μg的交联剂N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide(EDC)(Pierce Chemical，Rockford，IL)后，避光反应30分钟，再加入25μg交联剂(EDC)，再避光反应30分钟。反应结束后，用0.02％ Tween-20液洗一次，在用0.1％ SDS液洗涤一次。最后，将标记有探针的微球悬浮于TE，pH 8.0(10mMTris-HCl，1mM EDTA)，2-8℃避光保存。
二、样本246份临床的宫颈刷样本均经过杂交捕获法(Hybrid Capture 2，HCII)检测，其中140份被认为有高危HPV感染，另外106份检测结果为阴性。
三、实验方法(一)提取待测组织标本DNA用pH 7.2的PBS液将宫颈脱落细胞从细胞刷子上震荡洗脱下来，再PBS液洗2次。细胞被重悬于150μl裂解液(pH 8.0，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mM NaCl，0.5％ SDS，和200μg/ml蛋白酶K)56℃水浴1小时，95℃水浴15分钟灭活蛋白酶K。然后，通过酚-氯仿-异戊醇法和乙醇沉淀法(方法参照《分子克隆实验指南》98版)获得PCR用的DNA。
(二)待测样品的扩增与标记MY-PCR反应所使用的是MY09/11引物对，上游引物MY11为5’-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3’，下游引物MY09为5’-Bitoin-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3’(M＝A+C；R＝A+G；W＝A+T；Y＝C+T)。50-μl的PCR反应体系含5μl的模板DNA，0.1μM的上游引物MY11，0.8μM的生物素标记的下游引物Biotin-MY09，0.2mM的deoxynucleoside triphosphates(dNTPs)，2.5U的Taq DNA聚合酶(Promega，Shanghai，China)，1×反应缓冲液，4mM MgCl2。混匀后，放入PE9600PCR仪(Perkin-Elmer，Foster City，Calif.)进行扩增，反应条件为95℃变性5分钟，接下去进行40循环95℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，最后在72℃下延伸5分钟。5μl的上样量进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳(方法参照《分子克隆实验指南》98版)。
β-globin的基因扩增所用的是GH20/PC04引物对，引物GH20为5’-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’，引物PC04为5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’。β-globin的基因扩增的反应体系和扩增方法同MY-PCR，但引物分别被替换成0.2μM的GH20和0.2μM的PC04。
为了验证HPV悬浮芯片系统的特异性，我们用26种带生物素标记的与HPV型特异性探针序列互补的人工合成寡核苷酸，分别与HPV悬浮芯片系统进行杂交。
(三)杂交(避光操作)和上机检测0.2-ml的薄壁PCR管中，加入38μl的5×SSC杂交液(内含每一种标记有型特异性探针的微球各5000个)，加入12μl阳性对照或阴性对照或PCR产物(总体积50μl)。在PE 9600PCR仪上，95℃变性5分钟，55℃杂交15分钟。反应结束后，在96-well microtiter plates(Millipore Corporation，Bedford，MA 01730 U.S.A)上，100μl 2×SSC/0.02％ Tween-20液洗涤微球两次。最后，将重悬于75μl 2×SSC/0.02％ Tween-20液。加入25μl链酶亲和素—藻红蛋白复合物(Streptavidin-R-phycoerythrin，10μg/ml溶于2×SSC/0.02％ Tween-20)。避光室温反应5分钟。最后，在Luminex100analyzer上进行检测。
(四)E7型特异性PCR DNA序列鉴定E7型特异性PCR能对HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68等14型高危HPV进行检测，扩增引物和扩增方法参照Walboomers等所报道的。
(五)DNA序列鉴定E7型特异性PCR仅能对14种高危HPV进行检测。如果样本能被MY-PCR扩增而不能被E7型特异性PCR检测时，就对该MY-PCR产物进行测序鉴定。MY-PCR扩增产物经QIAquick PCR Purification kit纯化后，在Megabase 500自动DNA分析系统进行DNA序列鉴定。如果怀疑MY-PCR扩增产物含有两种类型以上的HPV DNA序列时，先将MY-PCR产物进行TA克隆，接着挑取单个克隆分别进行DNA序列鉴定。测序获得的序列分别在网上进行BLAST分析，用以确定是那一型的HPV(www.ncbi.nlm.nih.gov)。
四、结果(一)PCR质控MY-PCR扩增的同时，需进行β-globin基因的扩增，以此监控是否存在PCR抑制。特别是无MY-PCR扩增产物的样本，必须进行β-globin基因的扩增，以确认是真阴性还是假阴性。
(二)HPV基因芯片系统的特异性和检测极限26种带生物素标记的与HPV型特异性探针序列互补的人工合成寡核苷酸，分别与HPV基因芯片系统进行杂交。结果显示，每种微球与相应人工合成寡核苷酸(2nmol/L)的杂交信号都大于2000MIF，且HPV基因芯片系统具有良好的信号-噪声比，及未发现有交叉反应。
为了评估该HPV悬浮芯片系统的检测极限，我们对HPV16型的人工合成寡核苷酸进行梯度稀释，再分别与该检测系统进行杂交。结果显示，在我们的实验条件下，只要50μl的杂交体系中含有1.024×1014以上个拷贝数时，就能被该系统所检测出来。
(三)HPV基因芯片系统对临床样本的检测与分型1、MY-PCR结果246份临床样本均经过Hybrid Capture 2(HCII)检测，其中140份被认为有高危HPV感染，另外106份检测结果为阴性。140份阳性样本中的130份能获得MY-PCR的扩增产物。106份阴性样本中的3份也获得了MY-PCR的扩增产物，共133份样本MY-PCR结果阳性。
2、HPV悬浮芯片检测结果HPV悬浮芯片系统对133份MY-PCR扩增产物进行检测，结果见表1。133份MY-PCR扩增产物中有12份未能被HPV基因芯片系统所检测，结果见表1。对这12份MY-PCR扩增产物进行DNA序列测定，结果证实这12份产物所含有的HPV型不包含在本HPV悬浮芯片系统所能检测的26种HPV类型中。
121份经HPV基因芯片系统检测的MY-PCR扩增产物，同时也进行E7型特异性PCR检测或DNA序列鉴定。E7型特异性PCR检测或DNA测序鉴定的结果表明，HPV基因芯片系统检测对120份MY-PCR扩增产物检测的结果是正确的。只有1份MY-PCR扩增产物的检测结果与E7型特异性PCR检测或DNA鉴定的结果不一致。HPV基因芯片系统检测的结果显示，该样本感染有3种HPV，分别为HPV31，HPV66和HPV73。HPV31和HPV66能被E7型特异性PCR检测到，但是E7型特异性PCR和DNA测序都未能检测到HPV73。这个问题需做进一步的解决。
上述133份样本的检测结果都进行过3次重复，3次检测的结果是一致的。从上述结果来看，本HPV基因芯片系统的检测结果与常规的E7型特异性PCR或DNA测序的结果是一致的，表明本HPV基因芯片系统的检测结果是可靠的。
表1 MY-PCR，E7型特异性PCR(或DNA序列鉴定)检测结果与HPV基因芯片系统检测结果的比较
HPV基因芯片系统检测结果与E7型特异性PCR或DNA测序检测结果之间无统计学差异。(McNemar’s检验值＞0.9)
权利要求
1.一种用于26种人乳头瘤病毒的检测与分型的方法，其特征是将HPV6，HPV11，HPV16，HPV18，HPV26，HPV31，HPV33，HPV34，HPV35，HPV39，HPV40，HPV42，HPV43，HPV44，HPV45，HPV51，HPV52，HPV53，HPV54，HPV56，HPV58，HPV59，HPV66，HPV68，HPV73和HPV82这26种人乳头瘤病毒的型特异性探针交联在26种荧光微球上，与被测标本反应后，再与荧光素标记的报告分子反应，通过荧光检测仪检测人乳头瘤病毒的型特异性核酸。
2.按权利要求1所述用于26种人乳头瘤病毒的检测与分型的方法，其特征在于所述26种人乳头瘤型特异性探针序列如下
3.按权利要求1所述用于26种人乳头瘤病毒的检测与分型的方法，其特征在于所述26种人乳头瘤型特异性探针在26种荧光微球上的交联是每个探针与相应的荧光微球通过化学交联反应连接在一起。
4.按权利要求1所述的用于26种人乳头瘤病毒的检测与分型的方法，其特征在于检测与分型的主要步骤为(1)将标记好探针的微球体与被测标本混合，使之与被测标本中相应的目的分子特异性结合；(2)在步骤(1)中加入链酶亲和素-藻红蛋白复合物；(3)上述步骤的反应物经过荧光检测仪检测，通过检测到的荧光强度判断不同型人乳头瘤病毒的核酸含量。
5.按权利要求1所述的用于26种人乳头瘤病毒的检测与分型的方法，其特征是该方法用于人乳头瘤病毒的检测和分型诊断。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及人乳头瘤病毒基因检测的悬浮芯片技术，为一种用于26种人乳头瘤病毒的检测与分型的方法。本发明将HPV 6，－11，－16，－18，－26，－31，－33，－34，－35，－39，－40，－42，－43，－44，－45，－51，－52，－53，－54，－56，－58，－59，－66，－68，－73，和－82这26种人乳头瘤病毒的型特异性探针交联在26种荧光微球上，与被测标本反应后，再与荧光素标记的报告分子反应，通过荧光检测仪检测人乳头瘤病毒的型特异性核酸。本发明能一次检测26种常见类型HPV，大大提高了HPV的检测效率，克服了血清学和免疫组化检测方法对潜伏感染产生漏检的缺陷，实现对HPV疾病的早期诊断。并可按实际需要设计芯片探针数量。适用于临床检测人乳头瘤病毒及基因分型，以指导宫颈癌的防治。
文档编号G01N21/64GK1814796SQ20051006176
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月2日 优先权日2005年12月2日
发明者陈智, 蒋汉梁, 朱海红 申请人:浙江大学